CSN复合物在ATRA诱导APL细胞分化中的作用及其机制研究

发布时间：2017-08-19 06:20

  本文关键词：CSN复合物在ATRA诱导APL细胞分化中的作用及其机制研究

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【摘要】：研究目的:全反式维甲酸(ATRA)是第一个成功应用于白血病治疗的诱导分化药物,能够通过降解PML-RARα融合蛋白特异性诱导急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞分化成熟,因此已成为临床上治疗APL的首选药物。但至今为止,ATRA诱导细胞分化的作用机制仍未得到系统阐述。根据现有文献报道,维甲酸诱导基因G(RIG-G)可与COP9信号复合体(CSN)亚基CSN5相互作用,导致CSN复合物破坏并抑制其功能,提示CSN可能参与ATRA诱导的细胞分化;但是,其相关性研究仍未见报道。因此,本研究将重点研究CSN在ATRA诱导APL细胞分化过程中的作用,并探讨其可能的作用机制。具体研究内容分为三个部分:1)阐明CSN在ATRA诱导APL细胞分化过程中的变化情况;2)研究ATRA诱导分化中CSN-CRLs信号通路的变化;3)探讨CSN-CRLs信号通路调控PML-RARα自噬降解的分子机制。研究方法:1)选用人白血病细胞株NB4细胞为研究对象,以ATRA处理来考察ATRA诱导细胞分化过程中CSN的表达情况:应用吉姆萨染色观察细胞形态学改变;细胞经CD11b抗体孵育后采用流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b表达;应用RT-PCR检测细胞中CSN各亚基m RNA水平变化;应用Western blot检测CSN蛋白水平的变化。同时应用RT-PCR检测11例APL初诊患者和15例非血液疾病患者骨髓细胞中CSN3和CSN5的表达情况。2)选用人白血病细胞株NB4细胞为研究对象,采用Western blot检测ATRA诱导细胞分化过程中CSN-CRLs信号通路中CRLs支架蛋白cullin蛋白、底物识别蛋白及下游靶蛋白DEPTOR、DAPK1等的表达情况。3)选用人白血病细胞株NB4细胞为研究对象,应用Western blot和免疫荧光法检测ATRA诱导分化中细胞内自噬水平变化;选用293T细胞为瞬时表达宿主,共转染DAPK1和PML-RARα,通过Western blot检测分析DAPK1对PML-RARα蛋白的影响;分别以蛋白酶体抑制剂MG132和自噬抑制剂3-MA处理细胞进一步比较观察PML-RARα蛋白表达情况。研究结果:1)吉姆萨染色结果表明ATRA作用72小时后,NB4细胞分化为成熟粒细胞。同时,经流式细胞术检测细胞分化特异性抗原CD11b的表达,结果显示ATRA能够诱导NB4细胞发生分化,且呈时间依赖性变化。Western blot及RT-PCR等检测结果显示,ATRA作用后,CSN复合物及各亚基表达水平均明显下调,且与细胞分化进程相一致。此外,通过RT-PCR对临床患者进行检测,结果发现CSN3和CSN5在APL患者骨髓中的含量明显高于非白血病患者;经ATRA化疗缓解后,APL患者的CSN3和CSN5的m RNA表达水平均明显下降。进一步提示ATRA可以抑制CSN复合物的表达。2)鉴于CSN复合物在泛素蛋白酶体调节中的重要作用,进一步检测CSN-CRLs信号通路中相关蛋白的变化。Western blot检测结果显示,ATRA作用后,NB4细胞中CRLs支架蛋白cullin1和cullin3蛋白及其底物识别蛋白Skp2、βTr CP与KLHL20的表达都显著下降;同时,其下游靶蛋白DEPTOR、p27与DAPK1表达明显上调。这些结果表明CSN-CRLs-E3信号通路可能在APL发病以及ATRA诱导分化中发挥重要作用。3)由于DEPTOR、DAPK1等蛋白分子在细胞自噬调控中发挥着重要作用,而研究发现分化诱导剂ATRA可以增强APL细胞的自噬水平,并能促进PML/RARα蛋白降解。为了探讨DAPK1等蛋白的累积是否与ATRA诱导的PML/RARα蛋白的自噬降解有关,采用脂质体共转染PML/RARα和DAPK1至293T细胞,通过Western blot检测,结果显示DAPK1的过表达可促进PML/RARα蛋白的降解以及增强细胞自噬;在加入自噬抑制剂3-MA后,细胞自噬水平下降,同时DAPK1介导的PML/RARα蛋白降解作用明显减弱,提示DAPK1可以促进PML/RARα蛋白的降解,很可能与其介导的细胞自噬有关。结论:通过本课题的研究,首先,我们发现CSN在APL患者及NB4细胞株中呈高表达;而在ATRA作用后CSN的表达水平明显下调。其次,ATRA通过调节CSN-CRLs信号通路导致其下游靶蛋白DEPTOR、DAPK1等表达增加,而DAPK1可以促进PML/RARα融合蛋白的自噬降解。本研究较系统地探讨了CSN在ATRA诱导APL细胞分化中的作用及其相关机制,为进一步完善与发现新的诱导治疗方案提供了实验理论依据。
【关键词】：CSN复合物 急性早幼粒细胞白血病 CRLs-E3泛素连接酶 自噬
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.71
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英文缩略词对照10-11
• 第1章 前言11-16
• 第2章 材料与方法16-25
• 2.1 实验材料16-19
• 2.1.1 病例对象16
• 2.1.2 质粒与细胞株16
• 2.1.3 药物与主要试剂16-18
• 2.1.4 主要实验器材来源18-19
• 2.1.5 抗体19
• 2.2 常用溶液的配制19-21
• 2.2.1 电泳缓冲液19
• 2.2.2 PBS缓冲液19
• 2.2.3 SDS蛋白上样缓冲液19-20
• 2.2.4 10%过硫酸铵（APS）20
• 2.2.5 Tris-甘氨酸电泳缓冲液20
• 2.2.6 转膜缓冲液20
• 2.2.7 考马斯亮蓝染液20
• 2.2.8 洗脱液20
• 2.2.9 丽春红染色液20-21
• 2.2.10 DEPC水21
• 2.2.11 氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Kana）21
• 2.2.12 LB培养基21
• 2.2.13 100mM Cacl2配制21
• 2.3 实验方法21-25
• 2.3.1 细胞培养21-22
• 2.3.2 流式细胞术检测22
• 2.3.3 免疫印迹22
• 2.3.4 RT-PCR22-23
• 2.3.5 细胞转染23-24
• 2.3.6 免疫荧光24
• 2.3.7 统计学处理24-25
• 第3章 结果25-32
• 3.1 CSN复合物在全反式维甲酸诱导急性早幼粒细胞分化过程中的表达25-28
• 3.1.1 CSN在ATRA诱导的NB4细胞中的表达25-27
• 3.1.2 CSN复合物亚基在APL患者及其治疗过程中的表达27-28
• 3.2 全反式维甲酸诱导急性早幼粒细胞分化过程中CSN-CRLs信号通路的变化28-29
• 3.3 CSN-CRLs信号通路在全反式维甲酸诱导急性早幼粒细胞分化过程中的作用机制29-32
• 3.3.1 ATRA诱导NB4细胞自噬30
• 3.3.2 DAPK1参与调节的PML/RARα的自噬途径降解30-32
• 第4章 讨论32-35
• 第5章 结论35-36
• 致谢36-37
• 参考文献37-40
• 攻读学位期间的研究成果40-41
• 综述41-45
• 参考文献45

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本文编号：699156