胶质瘤干细胞诱发肿瘤免疫炎性微环境相关动物模型的研究

发布时间：2017-08-19 10:14

  本文关键词：胶质瘤干细胞诱发肿瘤免疫炎性微环境相关动物模型的研究

  更多相关文章： 胶质瘤干细胞 肿瘤免疫炎性微环境 双色荧光示踪动物模型

【摘要】：背景与目的:肿瘤微环境是指肿瘤细胞与宿主组织和细胞之间形成的相生相克的微生态环境。尽管近年有关肿瘤微环境的研究进展迅速,但所得数据受伦理学限止,仍然主要来源于实验动物模型而非人体,因此搭建模拟性高的实验动物模型平台还是肿瘤学研究者十分关注的重要问题。就肿瘤免疫炎性微环境而言,建立人肿瘤动物模型的要求比建立普通动物模型的要求更高,必须能确切地反映出那些被肿瘤细胞重构的肿瘤组织和肿瘤边缘的宿主源性免疫炎性细胞的来龙去脉,最好还要搞清楚这些细胞在肿瘤发生发展中所起的相生相克作用。基于上述原因,本文旨在本课题组早先建立表达红色荧光蛋白(RFP)的人脑胶质瘤干细胞和表达绿色荧光蛋白(GFP)的裸小鼠(RFP+/GFP+双色荧光示踪)模型的基础上,进一步探讨胶质瘤干细胞诱发肿瘤免疫炎性微环境的相关问题,尤其是高压氧如何改变肿瘤微环境的一些情况。材料与方法:接种用的人脑胶质瘤干细胞SU3和转RFP基因的SU3-RFP,表达绿色荧光蛋白的NC和Balbc裸小鼠,接种肿瘤细胞用的套管针和维持SPF级的高压氧治疗系统-HBOT/IVC都是本课题组研制的。接种肿瘤细胞的方法,根据接种部位的不同而有差别,若是脑内原位接种,则借助立体定向仪,经钻颅孔缓慢注射;若是皮下接种,则用套管针将肿瘤组织块或用青霉素皮试注射器将肿瘤细胞混悬液注入前肢腋下或足掌;若是肝脏接种,则须右肋缘切开,将肿瘤细胞通过微量泵缓慢注入肝组织内;若是腹腔接种,用青霉素皮试注射器将肿瘤细胞直接推注入腹腔即可。至于接种肿瘤细胞的量,根据接种部位和实验需要观察的指标而定,若是皮下接种肿瘤组织块,一般用1-3 mm3,细胞混悬液为106-107个细胞/0.5 ml培养液;若是脑和肝内接种,一般用细胞混悬液105个细胞/10-15μl培养液。至于肿瘤免疫炎性微环境观察,都需取移植瘤,必要时还要包括肿瘤边缘组织做冰冻切片和常规石蜡切片后在白光和荧光显微镜下观察表达GFP的细胞分布,通过ipps6.0软件量化分析其表达。若要鉴定在肿瘤及边缘组织显示gfp细胞中的免疫炎性细胞比例,则必须要用免疫组织化学方法检测这些细胞固有的标志蛋白。当然,也可通过组织消化后的混悬液用流式细胞仪进行测定比例,或采用分离收集培养等方法随实验目的不同而加以选择。为了观察高压氧对肿瘤的影响,将皮下接种su3的裸小鼠放置在hbot/ivc装置内进行高压氧治疗,每天一次,每次100分钟,连续21天,而单独化疗药acnu组小鼠给予腹腔注射acnu30mg/kg,每周一次,共3次,实验结束时取出肿瘤组织后进行称重。用微电极测定肿瘤组织内的氧含量。结果与分析:在脑内移植瘤组织中,光镜下可见肿瘤组织出血、坏死和血管增生,肿瘤细胞呈侵袭性生长的恶性表型。在荧光显微镜下,能清楚地可见发红色荧光的肿瘤细胞、发绿色荧光的宿主细胞和rfp/gfp双阳性的黄色细胞,在肿瘤坏死灶中和肿瘤边缘见有大量绿色的炎性细胞浸润。在皮下移植瘤组织中,可见肿瘤微环境相关蛋白和宿主髓源性抑制细胞(myeloid-derivedsuppressorcells,mdsc)的标记物包括hif-1α、tnf-α、ki67、cd68和cd11b的高表达,在移植瘤间质中,也可见有较多的gfp+、cd68+和cd11b+细胞。移植瘤经高压氧治疗后,肿瘤重量减轻,尤其与化疗药acnu合用的肿瘤重量更轻。在腹腔移植瘤组织的病理切片上,荧光显微镜下可见肿瘤结节中包含了rfp+红色细胞、gfp+绿色细胞及rfp+/gfp+的黄色细胞。在将肿瘤结节再培养后,gfp+细胞可恶性转化为高表达cd68的癌细胞。在足掌移植瘤近心端的肿瘤边缘组织,光镜下可见到肿瘤细胞核深染,异形性明显,核分裂常见,细胞排列密集,而在荧光镜下清晰地可见移植瘤组织中存在来源于循环血液的免疫炎性细胞。在肝移植瘤组织中,光镜下可见su3细胞在异位的肝组织内排列密集,核大、深染,并向周围正常肝组织侵袭生长。荧光镜下可见有绿色宿主细胞与红色肿瘤细胞的交织存在,其中包括肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associatedmacrophages,tam)。共聚焦显微镜下可进一步清楚地看到这两类细胞发生融合或吞噬的黄色细胞。经流式细胞仪检测到的红、绿和黄色细胞分别为73.65%、19.56%和6.79%。这些黄色细胞单克隆化后获得具有无限增殖能力的b4、b9和b10细胞,b4细胞可表达rfp/gfp,而b9和b10细胞仅表达gfp。b4细胞还表达cd1a、cd83和cd86等树突状细胞的分子标记蛋白,B9和B10细胞可分别表达CD68、F4/80和FAP-α、α-SMA、S100等巨噬细胞和成纤维细胞的分子标记蛋白,经病理诊断它们均为恶性肿瘤细胞。采用微电极测得移植瘤组织中氧含量,在常态下的头皮下移植瘤中的平均氧含量为(28.93±8.06)mmol/L,脑内移植瘤的平均氧含量为(47.46±15.96)mmol/L。经HBO治疗后,脑内移植瘤在治疗出窗时的平均氧含量增加为(86.61±10.91)mmol/L,与前者相比有显著差异(P0.01)。HBO治疗后的免疫炎性细胞明显减少。结论:(1)本课题组所建的RFP+/GFP+双色荧光分别示踪人脑胶质瘤干细胞和宿主组织细胞的模型,与传统人脑胶质瘤干细胞移植普通裸小鼠模型相比,其独特的优势除了依赖荧光显微镜就可以区别出肿瘤微环境中哪些是肿瘤细胞,哪些是肿瘤间质细胞外,还能界定出RFP+/GFP+共定位在一个细胞上的黄色细胞,即是肿瘤细胞与宿主细胞发生了融合的细胞;(2)基于肿瘤免疫炎性反应是肿瘤局部的全身性反应,而且参与反应的细胞,主要来自骨髓中的髓源性抑制细胞,因此肿瘤细胞接种部位相对不重要,重要的是如何鉴定和量化这些免疫炎性细胞;(3)RFP+/GFP+的人脑胶质瘤干细胞移植瘤模型,对研究肿瘤微环境而言,可进一步用于肿瘤微环境对肿瘤生长、侵袭、播散和转移等起正面或负面影响、以及肿瘤微环境细胞自身恶性转化及其耐放化疗等多方面的研究;(4)通过本模型证明,HBO治疗可改善肿瘤微环境乏氧而抑制肿瘤免疫炎症反应来提高胶质瘤化疗的敏感性。
【关键词】：胶质瘤干细胞 肿瘤免疫炎性微环境 双色荧光示踪动物模型
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 研究背景12-15
• 材料与方法15-19
• 结果19-26
• 讨论26-29
• 小结29-30
• 参考文献30-35
• 综述:高压氧联合放化疗治疗肿瘤的研究现状35-44
• 参考文献39-44
• 缩写词表44-45
• 攻读硕士学位期间公开发表的论文45-46
• 致谢46-47

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 王莉莎;;社长的话[J];中国组织工程研究与临床康复;2009年12期

2 张慈安;魏品康;李勇进;;肿瘤酸性微环境的研究进展[J];肿瘤;2010年06期

3 姚志麟;;三个人口组在各种微环境中的一氧化碳暴露和总暴露[J];国外医学(卫生学分册);1986年03期

4 程鸿,杨幼明,张帆;笼内换气对微环境的影响[J];中国实验动物学杂志;1991年Z1期

5 彭玉萍;;营造科学的睡眠微环境[J];家庭医药(快乐养生);2013年03期

6 徐锐;;打造睡眠微环境[J];家庭医药(快乐养生);2013年02期

7 杨沁怡;谢欣怡;;肿瘤炎性微环境与肿瘤的发生发展[J];医学信息(中旬刊);2011年08期

8 唐代彬;李树清;;神经元微环境及其调节[J];中国微循环;2008年01期

9 徐靓;季峰;;肿瘤酸性微环境与抗肿瘤耐药对策研究进展[J];国际消化病杂志;2010年02期

10 孙灵芝;庄伟端;;内源性神经干细胞的原位激活与微环境[J];中国医药导报;2012年34期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 余秀芳;蒋贤辉;;关注微环境创建农业健康生态[A];科技、工程与经济社会协调发展——中国科协第五届青年学术年会论文集[C];2004年

2 徐志刚;刘晓英;焦学磊;;基于C8051F005的新型组培气体微环境调控系统的研制与试验[A];中国农业生物技术学会第三届会员代表大会暨学术交流会论文摘要集[C];2006年

3 蔡尤溪;胡石政;吴仁杰;骆志辉;;超洁净微环境设计参数之实验与模拟研究[A];第五届海峡两岸制冷空调技术交流会论文专辑[C];2001年

4 王方;;展柜微环境控制的应用研究[A];中国文物保护技术协会第七次学术年会论文集[C];2012年

5 李福山;;肝癌复发、转移与微环境调节[A];2013年广东省肝脏病学会《全国肝病防治高峰论坛》深圳会议讲义汇编[C];2013年

6 邓方阁;张秀英;王心蕊;李玉林;;体外模拟心肌微环境对人骨髓间充质干细胞向心肌分化的影响[A];中华医学会病理学分会2006年学术年会论文汇编[C];2006年

7 杨长青;杨丽;常义忠;陈锡美;;整合素α1β1和α1β2是纤维化微环境中肝肿瘤细胞浸润的主要介导因素[A];中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编（下册）[C];2007年

8 申俊;周红梅;;肿瘤-宿主界面微环境中的细胞交互作用模型研究[A];中华口腔医学会第六届全国口腔黏膜病学术会议论文集[C];2004年

9 蒋宏亮;康成军;蔡国强;於麟;王利群;;肿瘤弱酸性微环境响应性壳聚糖基多层次胶束:高级组装与解组装研究[A];2011年全国高分子学术论文报告会论文摘要集[C];2011年

10 许嘉;高佳佳;高莹;金陶胜;;天津市典型交通微环境内颗粒物的个体暴露研究[A];2010年海峡两岸环境与能源研讨会摘要集[C];2010年

中国重要报纸全文数据库 前7条

1 刘海;“微环境”时刻影响儿童健康成长[N];新华每日电讯;2003年

2 孙国根;肿瘤发生、恶化的“微环境”可被清除[N];中国医药报;2013年

3 小舒;搞科研的微环境十分重要[N];中国医药报;2006年

4 记者 胡其峰;我科学家实现脑细胞生存微环境可视[N];光明日报;2013年

5 编译 李勇;微环境可作为抗癌药研发新靶点[N];中国医药报;2013年

6 辽宁中医药大学 郑洪新　上海中医药大学附属龙华医院 王拥军;探索“肾藏精”与干细胞及其微环境及NEI网络动态平衡关系[N];中国中医药报;2011年

7 唐晓景 渠红丽;最好的时代与最优的微环境[N];东营日报;2013年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 张博;高糖微环境通过GSK3β调控Cyclin D1、CXCR-4影响大鼠骨髓间充质干细胞增殖迁移[D];中国人民解放军医学院;2015年

2 张雪;软骨微环境及细胞起源对再生软骨类型的调控作用[D];北京协和医学院;2016年

3 许小青;化学小分子诱导的蛋白质活性中心周围微环境的变化[D];南京师范大学;2016年

4 王凯;蜂胶对炎性疾病和炎症微环境的影响及其作用机制[D];浙江大学;2016年

5 徐春雯;室内空气稳定性对人体呼吸微环境的影响[D];湖南大学;2014年

6 宋敏;DJ-1蛋白对肺癌微环境的调节作用及其与EGCG防癌的关系[D];中南大学;2010年

7 高剑;新疾病外伤后细菌性致死性肉芽肿病原菌——痤疮丙酸杆菌生物膜三维模型重建及生物膜与微环境pH的相互作用[D];第四军医大学;2010年

8 朱秀委;数学肿瘤学的研究与应用：微环境的作用[D];浙江大学;2011年

9 徐志刚;组培微环境与规模化育苗设施环境调控的研究[D];南京农业大学;2002年

10 谢华桃;角膜上皮干细胞与基质微环境细胞的紧密连接及其机制的研究[D];华中科技大学;2012年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 孙志平;结核分枝杆菌BSL-3实验室微环境表面污染检测及消毒的研究[D];复旦大学;2014年

2 朱爱林;COPD微环境对A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响[D];第四军医大学;2015年

3 朱蔚沫;基于城市微环境PM_(2.5)暴露的人群健康风险研究[D];南京大学;2016年

4 谢涛;胶质瘤干细胞诱发肿瘤免疫炎性微环境相关动物模型的研究[D];苏州大学;2016年

5 贺宇姣;网络微环境下中学思想政治课教学实效性研究[D];陕西师范大学;2015年

6 韩远青;车载微环境监控系统的设计与实现[D];中山大学;2014年

7 侯彦年;敦煌莫高窟微环境控制系统的设计与实现[D];北京交通大学;2014年

8 王雪晴;典型交通微环境空气中15种邻苯二甲酸酯的污染特征及健康风险[D];浙江大学;2015年

9 刘迎辉;基于低温微环境的肺癌发生与川乌治疗研究[D];河南大学;2015年

10 刘淼;不同微环境下木葡萄糖醋杆菌的代谢组学研究[D];天津科技大学;2014年

，

本文编号：700137