Bmi1干性肝癌细胞系的鉴定及其对肝癌胆管细胞样表型转变的影响

发布时间：2017-08-20 09:03

  本文关键词：Bmi1干性肝癌细胞系的鉴定及其对肝癌胆管细胞样表型转变的影响

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【摘要】：研究背景和目的:肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)在全球范围内具有极差的预后,这与肝癌极其复杂的肿瘤异质性密切相关。近来研究发现,肝癌的肿瘤异质性主要由肿瘤细胞的干性分子决定,肿瘤细胞干性分子的表达决定了肿瘤的生物学特性,包括肿瘤细胞的增殖活性、侵袭转移能力、化疗抵抗以及对不同临床治疗方式产生的反应。因此,如何对肿瘤不同的干性特征进行界定,可以为肿瘤异质性提供理论基础,为肿瘤临床的个体化治疗及复发防治提供指导和策略。我们前期研究发现,慢性肝脏疾病背景下肝前体细胞(Hepatic progenitor cell,HPC)活化与术后混合型肝癌的复发和预后显著相关,肿瘤的癌旁胆管反应(Ductular reaction,DR)的增殖状态(Proliferative index of ductular reaction,PIDR)与肝脏中肝前体细胞的活化具有显著的正相关性,HPC活化可影响肿瘤内一系列干性指标(EpCAM、CK7、CK19等)的表达(Hepatology,2012),提示癌旁的干性特征可影响到肿瘤的异质性。因此,对癌及癌旁的干性特征进行界定,对于临床预后判断及分子分型具有重要意义。我们进一步在肝细胞癌和混合型肝癌的研究中还发现,肿瘤内协同出现EpCAM、Bmi1、CK7、CK19、Twist等干性分子表达时,随着这些干性分子表达数量的增加,肿瘤可表现出更高的恶性程度,患者的预后更差,而对应的肿瘤癌旁的PIDR、HPC也出现了更高的活化。提示这些分子表达的多少及数量可能影响到肿瘤的异质性,并可将它们作为预后判断及分子分型的重要依据。我们在肿瘤复发过程中也发现相似的结果。在肿瘤复发行多次手术的患者中,部分患者初次手术时肿瘤表现为Bmi1及EpCAM等多种干性分子共同表达的特征,其癌旁HPC活化显著增强。令人感兴趣的是,患者复发行二次手术时,肿瘤恶性程度与上述共表达干性分子密切相关,有些患者还可出现病理类型的转变,即由肝细胞癌转变为胆管细胞癌或混合型肝细胞-胆管细胞癌。此外,我们研究还发现癌旁胆管反应的增殖指数与干性分子bmi1的表达具有相关性,说明bmi1可在某种程度上影响hpc的活化状态,在hcc的发生发展中可能具有重要作用。鉴于此,本课题主要对上述研究中的关键分子bmi1在肝癌中的作用进行深入研究。干性分子bmi1广泛参与细胞的增殖与分化,调控细胞衰老,从而改变细胞的生物学特性,并与多种肿瘤的发生发展密切相关。近年来,相关学者研究发现bmi1能够通过介导上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,emt)的发生促进乳腺癌、鼻咽癌及前列腺癌等多种实体肿瘤发生侵袭转移,从而影响患者的预后。那么,在高转移复发率,较差的临床预后的肝细胞癌中,干性分子bmi1与hcc的侵袭转移是否相关呢,其具体作用及机制尚未明确,成为近年来研究肝癌转移及预后的一个热点。我们前期在对混合型肝癌的研究中发现,癌旁hpc的活化与肿瘤内ck7、ck19的表达呈正相关,说明了hpc活化激活了肿瘤内前体细胞/胆管细胞标记物的表达,使肝癌细胞获得前体细胞/胆管细胞样表型。另有学者研究发现hnf-1β能够使肝癌细胞获得但管细胞样表型,表达胆管上皮标记物ck7及ck19,导致较差的预后,并且可能与患者术后病理亚型发生转变相关。肝细胞癌,特别是一小部分肝癌亚型,能够同时表达肝细胞标记物及胆管细胞标记物,而我们在临床上也观察到某些肝癌在术后复发可表现为不同的病理亚型,但是其中的具体机制尚未明确,成为我们本课题研究的一个方向。因此,本课题旨在分析:1.bmi1干性表达肝癌细胞系的功能鉴定及其机制研究;2.不同干性分子表达huh7肝癌细胞系的鉴定及其对肝癌胆管细胞样表型转变的影响。通过上述研究,以期对肝癌复杂的肿瘤异质性及对肿瘤病理类型转变的机制进行更深入的探讨。研究方法及结果:第一部分:bmi1干性表达肝癌细胞系的功能鉴定及其机制研究。采用慢病毒转染技术构建肝癌细胞系huh7及肝脏正常细胞系l02bmi1过表达细胞株以及肝癌细胞系smmc-7721bmi1干扰细胞株,观察细胞株的生物学特性及侵袭转移能力的变化。采用cck-8实验检测细胞株的增殖活性,5-fu处理后检测细胞株化疗耐药性,克隆形成实验检测细胞集落形成能力,划痕及transwell实验检测细胞侵袭和转移能力。侵袭转移机制研究中,利用real-timepcr与western-blot及细胞免疫荧光技术检测上皮间质转化过程中的分子标记物e-cadherin及vimentin的变化。结果显示:1.干性分子bmi1能够增强细胞株的增殖、耐药性及克隆形成能力,改变细胞的生物学特性。2.过表达bmi1能够增强细胞株的迁移侵袭性,real-timepcr与western-blot及细胞免疫荧光技术发现其机制可能是通过emt促进细胞转移。干扰肝癌细胞系bmi1表达后则出现相反的结果。第二部分:不同干性分子表达huh7肝癌细胞系的鉴定及其对肝癌胆管细胞样表型转变的影响。采用慢病毒转染技术分别构建肝癌细胞系huh7bmi1高表达、epcam高表达及bmi1和epcam共高表达细胞株。采用cck-8、集落形成、transwell及裸鼠皮下成瘤实验检测细胞株的干性特征。利用western-blot技术检测emt标记物e-cadherin及vimentin的变化,同时检测肝细胞标记物hnf4a及前体细胞/胆管细胞标记物ck19的表达情况。结果显示:1.干性分子bmi1及epcam的表达能够增强细胞的增殖、克隆形成及皮下成瘤能力,bmi1与epcam的共过表达可以明显增强细胞的增殖、克隆形成及皮下成瘤能力。2.transwell实验发现过表达bmi1细胞株与bmi1及epcam共过表达细胞株无显著差异,但较过表达epcam细胞株具有明显差异。进一步用western-blot实验检测emt标记物证实,过表达bmi1细胞株与bmi1及epcam共过表达细胞株发生emt,而过表达epcam细胞株并未出现此特征性改变。3.western-blot实验检测肝系胆系标记物发现,不同干性表达的huh7细胞株肝系标记物hnf4a表达明显下降,前体细胞/胆管细胞标记物ck19表达显著升高。结论:干性分子bmi1的表达能够影响肝癌细胞的生物学特性,通过介导emt的发生促进肝癌细胞的侵袭转移。肝癌细胞内不同干性分子的表达能够增强肝癌细胞的干性特征,干性分子激活越多,干性特征越强。细胞内干性分子表达可使肝癌细胞获得肝前体细胞/胆管细胞样表型,能够表达前体细胞/胆管细胞标记物,可能与肿瘤复发病理亚型转变相关。
【关键词】：肝细胞癌 Bmi1 干性 上皮间质转化 前体细胞/胆管细胞标记物
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 摘要4-8
• Abstract8-12
• 第一部分 BMI1干性表达肝癌细胞系的功能鉴定及其机制研究12-34
• 前言12-14
• 实验方法14-20
• 实验内容20
• 实验结果20-28
• 讨论28-30
• 参考文献30-34
• 第二部分 不同干性分子表达HUH7肝癌细胞系的鉴定及其对肝癌胆管细胞样表型转变的影响34-47
• 前言34-35
• 实验方法35-37
• 实验内容37
• 实验结果37-43
• 讨论43-45
• 参考文献45-47
• 综述47-56
• 参考文献51-56
• 附录56-67
• 研究生期间公开发表的论著67
• 研究生期间参与的科研工作67-68
• 致谢68-70

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本文编号：705693