永生化食管上皮恶变细胞中核干细胞因子对细胞增殖的影响

发布时间：2017-08-21 05:23

  本文关键词：永生化食管上皮恶变细胞中核干细胞因子对细胞增殖的影响

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【摘要】：背景中国的食管癌发病率和死亡率均远高于世界平均水平,细胞增殖异常与食管癌的发生发展密切相关。核干细胞因子(nucleostemin,NS)是一个重要的细胞增殖调节因子,可维持干细胞和癌细胞的增殖,并保持细胞不分化。本项目在前期研究的基础上,将采用永生化食管上皮细胞系(SHEE)及其恶变细胞系(SHEEC),测定SHEE及SHEEC中NS、细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)和抑癌基因PTEN的m RNA和蛋白的表达变化,用RNA干扰技术降低NS表达,观察对细胞恶性变的影响。本项目对揭示NS在SHEEC食管癌细胞中对细胞增殖的影响具有重要意义。目的观察永生化食管上皮恶变细胞中核干细胞因子对细胞增殖的影响方法1.SHEE和SHEEC细胞传代培养,应用RT-PCR及Western Blot方法分别检测SHEE和SHEEC细胞中NS、细胞周期蛋白B1(cyclin B1)及人第10号染色体缺失的磷酸酶(PTEN)的表达。2.设计并合成NS si RNA,转染SHEEC细胞,实验分为3组,分别为试剂对照组(Mock)、阴性对照组(NC)及转染组(NS-1543),应用RT-PCR及Western Blot方法分别检测各组NS、cyclin B1及PTEN的表达变化。3.应用MTT法检测各组细胞增殖活性,PI染色和Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞周期和凋亡变化。4.统计学处理均采用SPSS17.0统计软件,统计学数据用均数±标准差(X±S)表示,两组均数比较用t检验;多组均数间的比较采用单因素方差分析,多组均数间的两两比较采用LSD方法,检验水准α=0.05。结果1.SHEEC细胞中NS、Cyclin B1及PTEN m RNA相对于SHEE的表达量分别为2.047±0.507、2.214±0.213及0.668±0.188,差异均有统计学意义(P0.05)。2.SHEE及SHEEC中NS、Cyclin B1及PTEN蛋白表达量分别为(1.142±0.113,3.161±0.108)、(1.585±0.056,2.173±0.058)、(1.894±0.341,1.162±0.524),均为P0.05。3.沉默SHEEC中NS表达后,Mock组、NC组和NS-1543组Cyclin B1、PTEN m RNA和蛋白相对表达量分别为(1.057±0.054,0.998±0.104,0.621±0.133)、(1.069±0.059,0.999±0.085,2.319±0.148)和(1.913±0.177,1.735±0.275,0.597±0.103)、(0.791±0.382,0.880±0.077,2.409±0.058),均为P0.05。4.下调SHEEC中NS表达量后,Mock组、NC、NS-1543组细胞凋亡率分别为7.233±0.427、9.318±0.703、33.667±2.517,P0.05。细胞周期G0/G1期细胞百分比增加,S期和G2/M期细胞百分比降低,P0.05。5.下调SHEEC中NS表达,转染24h、36h及48h的NS-1543组细胞增殖活性分别较Mock组和NC组降低,P0.05,差异均具有统计学意义。结论1.沉默NS表达可阻滞细胞周期于G0/G1期,抑制SHEEC细胞的增殖,促进细胞凋亡,且伴随Cyclin B1表达的降低和PTEN表达的增加。2.NS可以促进SHEEC细胞的增殖。
【关键词】：永生化食管上皮细胞 永生化食管上皮恶变细胞 核干细胞因子 细胞周期蛋白B1 人第10号染色体缺失的磷酸酶 细胞增殖
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.1
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-13
• 中英文缩略词表13-15
• 1 前言15-18
• 2 材料与方法18-36
• 2.1 材料18-22
• 2.1.1 细胞来源18
• 2.1.2 实验试剂18-19
• 2.1.3 主要仪器19-20
• 2.1.4 主要试剂配置20-22
• 2.2 方法22-36
• 2.2.1 方法流程图22-23
• 2.2.2 细胞培养23-24
• 2.2.3 RT-PCR检测永生化食管上皮细胞系SHEE及其恶变细胞系SHEEC中核干细胞因子NS、Cyclin B1、PTEN m RNA的表达24-28
• 2.2.4 Western blot检测各组中目的基因的蛋白表达情况28-31
• 2.2.5 细胞转染31-34
• 2.2.6 PI染色检测细胞周期34
• 2.2.7 Annexin V-FITC/PI双染法检测NS沉默前后对SHEEC细胞凋亡率的影响 .34-35
• 2.2.8 MTT法检测NS沉默前后细胞增殖活性35
• 2.2.9 统计分析35-36
• 3 结果36-50
• 3.1 RT-PCR检测SHEE、SHEEC中NS、Cyclin B1及PTEN的m RNA表达变化36-40
• 3.1.1 RNA纯度和完整性检测结果36
• 3.1.2 Real-Time PCR结果36-40
• 3.2 Western blot检测SHEE、SHEEC中NS、Cyclin B1及PTEN的蛋白表达变化40-42
• 3.2.1 BCA蛋白浓度测定40-41
• 3.2.2 SHEE及SHEEC中NS、Cyclin B1、PTEN蛋白表达水平41-42
• 3.3 NS基因抑制结果42-50
• 3.3.1 SHEEC细胞的转染条件42-43
• 3.3.2 最佳干扰链的筛选43-44
• 3.3.3 抑制SHEEC细胞NS表达对增殖相关指标Cyclin B1和PTEN m RNA的影响44-45
• 3.3.4 SHEEC细胞NS低表达对NS、Cyclin B1和PTEN蛋白的影响45-46
• 3.3.5 细胞凋亡率检测46-47
• 3.3.6 抑制NS表达对细胞周期的影响47-48
• 3.3.7 MTT法检测抑制SHEEC中NC表达对细胞增殖的影响48-50
• 4 讨论50-56
• 4.1 NS、Cyclin B1及PTEN在SHEE、SHEEC及基因沉默SHEEC细胞中的表达50-52
• 4.1.1 NS在SHEEC细胞中高表达50-51
• 4.1.2 Cyclin B1在SHEEC细胞中高表达51
• 4.1.3 PTEN在SHEEC细胞中低表达51-52
• 4.2 设计合成针对NS的si RNA及其干扰效果52-53
• 4.3 NS（核干细胞因子）是细胞增殖调节因子53-54
• 4.4 NS表达下调对细胞凋亡及周期的影响54-55
• 4.5 NS si RNA干扰的临床应用前景55-56
• 结论56-57
• 参考文献57-62
• 综述62-74
• 参考文献70-74
• 个人简历74-75
• 致谢75

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本文编号：711075