FTY720对肿瘤免疫微环境的调节作用及其机制研究

发布时间：2017-08-21 13:14

  本文关键词：FTY720对肿瘤免疫微环境的调节作用及其机制研究

  更多相关文章： 肠炎相关结直肠癌 髓源抑制性细胞 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 1-磷酸鞘氨醇 FTY720

【摘要】：背景FTY720作为新型免疫抑制剂,在自身免疫病等炎症相关疾病中显示良好的治疗效果,已被被美国FDA批准用于多发性硬化病的临床治疗。目前的研究表明,FTY720的主要作用机制是通过结合1-磷酸鞘氨醇(S1P)受体,促使其内化,阻断或下调S1P介导的信号传递,从而发挥功能性拮抗剂的作用,阻滞效应性淋巴细胞于淋巴器官中,减少病灶组织中的效应细胞的浸润,从而抑制疾病的发生发展。近年来的研究发现,FTY720对肿瘤细胞同样有着良好的抑制效果,能够促进癌细胞的凋亡。然而,大量研究证实,肿瘤微环境,特别是肿瘤免疫微环境在肿瘤发生发展中起着非常重要的作用。肿瘤细胞能够分泌多种生长因子/趋化因子,刺激骨髓或髓外造血器官中髓系细胞的异常分化和增生,造成具有免疫抑制功能的不成熟的髓系细胞MDSC在各器官和肿瘤周围的大量聚集,破坏机体的免疫监视,这被认为是肿瘤免疫微环境形成的关键步骤。因此,我们提出以下科学问题:FTY720作为公认的免疫调节剂,是否影响肿瘤免疫微环境,特别是MDSC的累积,进而调控癌细胞的生长?为此,我们将在已建立的多个荷瘤模型中,评价FTY720的效应。并以MDSC的异常增生为研究着力点,探究FTY720对髓外造血和MDSC累积的影响及其机制。目的探讨FTY720在肿瘤生长中的作用及其机制。方法在UC相关结直肠癌(CAC)的小鼠模型模型和移植瘤模型上,每天口服FTY720(1mg/kg/天),直至实验。同时,设立FTY720末期治疗组(CAC建模后开始口服FTY720,剂量同上,直至实验)。每天测量肿瘤尺寸,计算肿瘤体积。分离脾脏组织,病理分析和流式细胞术判断髓外造血,同时借助流式细胞术检测各组织器官中的MDSC数量。ELISA和定量RT-PCR检测血浆中和细胞内GM-CSF含量。FACS分选MDSC,予以S1P和相应的激动剂/拮抗剂体外刺激,定量RT-PCR检测GM-CSF表达;2.建立CT26和B16移植瘤模型;3.建立CAC模型的评价体系;4.通过灌胃途径评价药物对肿瘤生长的影响5.由病理切片判断髓外造血情况;6.检测小鼠外周血、脾脏、骨髓以及结肠病灶部位MDSC的含量;7.FACS或磁珠分选外周血MDSC;8.检测小鼠血浆以及MDSC中GM-CSF表达水平。9.FACS和QPCR检测CAC模型中S1P受体的表达;10.S1P以及S1P受体拮抗剂和激动剂体外刺激MDSC对GM-CSF释放的影响。结果FTY720小鼠的肿瘤负荷明显增加。进一步研究发现,荷瘤小鼠MDSC细胞高表达,可有效抑制淋巴细胞的增殖。进一步研究FTY720驱动髓外造血和MDSC累积的机制发现FTY720灌胃后GM-CSF高表达。腹腔注射GM-CSF抗体,可明显阻断FTY720效应,S1P受体3激动剂刺激MDSC可显著促进GM-CSF的表达,S1PR1激动剂刺激则无此效应。口服S1PR3激动剂Cym5541可促进CAC模型小鼠的髓外造血和MDSC累积。结论我们证实了FTY720可促进肿瘤的生长和进展。对其作用机制研究发现,口服FTY720可显著促进脾脏的髓外造血从而导致MDSC(尤其是G-MDSC)在外周(外周血、脾脏)和肿瘤部位的大量累积。GM-CSF是FTY720促使髓外造血过程中的重要因子。FTY720/S1P主要通过与S1PR3结合增加GM-CSF的表达从而促进MDSC的累积。
【关键词】：肠炎相关结直肠癌 髓源抑制性细胞 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 1-磷酸鞘氨醇 FTY720
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.3
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 缩略词表8-12
• 前言12-16
• 第一部分:FTY720对肿瘤生长的效应评价16-22
• 1.1 引言16
• 1.2 材料16-17
• 1.2.1 实验动物16
• 1.2.2 细胞系16
• 1.2.3 仪器16-17
• 1.2.4 试剂17
• 1.3 方法17-18
• 1.3.1 AOM+DSS联合诱导的UC相关大肠癌小鼠模型的建立17
• 1.3.2 小鼠CAC模型的评价体系17
• 1.3.3 CT26和B16移植瘤小鼠模型的建立17
• 1.3.4 FTY720或S1PR激动/拮抗剂给药途径剂量的确定17-18
• 1.3.5 统计分析18
• 1.4 结果18-21
• 1.4.1 在UC相关大肠癌模型上全程以及末期口服FTY720对小鼠肿瘤生长的影响18-20
• 1.4.2 移植瘤小鼠模型上口服FTY720对肿瘤生长的影响20-21
• 1.5 讨论21-22
• 第二部分：FTY720增强荷瘤小鼠的髓外造血和MDSC的累积22-40
• 1.1 引言22
• 1.2 材料22-23
• 1.2.1 实验动物22-23
• 1.2.2 细胞系23
• 1.2.3 仪器23
• 1.2.4 试剂23
• 1.3 方法23-29
• 1.3.1 AOM+DSS联合诱导的UC相关大肠癌小鼠模型的建立23
• 1.3.2 CT26和B16移植瘤模型的建立23
• 1.3.3 FTY720或S1PR激动/拮抗剂给药途径剂量的确定23
• 1.3.4 病理和免疫组化23-24
• 1.3.5 FACS检测脾脏、骨髓中c-kit+的表达含量24-25
• 1.3.6 小鼠直结肠上皮细胞的分离25
• 1.3.7 小鼠结直肠固有层细胞分离25
• 1.3.8 小鼠外周血中MDSC的检测25
• 1.3.9 小鼠脾脏中MDSC的检测25-26
• 1.3.10小鼠骨髓中MDSC的检测26
• 1.3.11小鼠肠道部位MDSC的检测26
• 1.3.12 FACS分选脾脏、骨髓、结肠部位的MDSC26-27
• 1.3.13 磁珠分选脾脏、骨髓、结肠部位的MDSC27
• 1.3.14 实时定量PCR(Quantitative RT-PCR)27-28
• 1.3.15 全血细胞计数28
• 1.3.16 高效液相色谱检测肠培养上清中28
• 1.3.17 统计分析28-29
• 1.4 结果29-38
• 1.4.1 FTY720增强荷瘤小鼠的髓外造血29-31
• 1.4.2 CAC小鼠外周血中MDSC数量的检测31-34
• 1.4.3 在CAC模型上口服FTY720对MDSC累积的影响34-38
• 1.4.4 FT720上调MDSC中i NOS2表达38
• 1.5 讨论38-40
• 第三部分：FTY720通过促进GM-CSF的分泌增强髓外造血和MDSC累积40-52
• 1.1 引言40
• 1.2 材料40
• 1.2.1 实验动物40
• 1.2.2 仪器40
• 1.2.3 试剂40
• 1.3 方法40-42
• 1.3.1 AOM+DSS联合诱导的UC相关大肠癌小鼠模型的建立40-41
• 1.3.2 FTY720或S1PR激动/拮抗剂给药途径剂量的确定41
• 1.3.3 病理和免疫组化41
• 1.3.4 小鼠外周血、脾脏、骨髓以及结肠部位MDSC的检测41
• 1.3.5 磁珠分选脾脏、骨髓、结肠部位的MDSC41
• 1.3.6 实时定量PCR(Quantitative RT-PCR)41
• 1.3.7 S1P以及S1PR激动剂或拮抗剂对G-MDSC的体外刺激试验41
• 1.3.8 GM-CSF中和抗体体内阻断FTY720效应41
• 1.3.9 酶联免疫吸附实验（ELISA）41-42
• 1.3.10 统计分析42
• 1.4 结果42-51
• 1.4.1 GM-CSF是联系FTY720与髓外造血MDSC累积的关键因子42-45
• 1.4.2 S1P与S1PR3结合促进G-MDSC释放GM-CSF45-48
• 1.4.3 S1PR3选择性激动剂cym5541增强荷瘤小鼠髓外造血和MDSC累积48-50
• 1.4.4 S1PR3选择性激动剂cym5541可促进移植瘤小鼠的髓外造血和MDSC的累积50-51
• 1.5 讨论51-52
• 小结52-56
• 参考文献56-60
• 综述60-66
• 参考文献63-66
• 攻读学位期间主要的研究成果66-67
• 致谢67-69

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本文编号：713073