RRBS数据分析新流程的建立及其在肿瘤细胞中等位基因特异甲基化分析的应用

发布时间：2017-08-21 14:02

  本文关键词：RRBS数据分析新流程的建立及其在肿瘤细胞中等位基因特异甲基化分析的应用

  更多相关文章： RRBS 肿瘤 DNA甲基化 DNMT3A UHRF1 ASM

【摘要】：DNA甲基化是非常重要的表观遗传修饰之一,在胚胎发育、细胞分化、X染色体失活、基因组印记、肿瘤发生等方面扮演着重要的角色。DNA甲基化谱式异常是肿瘤的重要特征之一,目前在大部分肿瘤细胞中都发现了整体的DNA甲基化水平降低和部分区域的甲基化水平增高,但具体的DNA甲基化异常的分子机制目前尚不清楚。简化的有代表性的重亚硫酸盐测序(RRBS)技术是近年来发明的全基因组水平的DNA甲基化分析技术,但是因为其数据分析的复杂性,现有的分析软件不能完全满足研究的需要。起始性DNA甲基转移酶DNMT3A在肿瘤细胞DNA甲基化谱式异常中的作用并不清楚,我们利用RRBS技术检测了在肺癌细胞A549中过表达DNMT3A之后基因组DNA甲基化的谱式变化。通过完善数据分析流程后,我们发现过表达DNMT3A之后,基因组DNA整体甲基化上升了9.1%,并且这种上升在不同基因特征区域间没有显著差异。另外,起始性的DNA甲基化变化比例并不高,更多的是已有甲基化水平的少量上升,而且重复序列的甲基化水平也呈现与整体相当的上升。进一步区域分析发现,过表达DNMT3A导致一些基因启动子区起始性的高甲基化,包括了RFPL3、 TFAP2E等,可能参与抑制肿瘤细胞的生长。以上结果显示DNMT3A在肿瘤细胞中参与DNA甲基化水平维持,并能调控一些肿瘤相关基因的启动子区甲基化水平。接下来,我们开发了单个分子连续CpG甲基化连锁分析方法,并加入了DNA甲基化与单核苷酸多态性连锁分析以及DNA甲基化与基因表达相关性分析。利用这些分析手段,我们发现肿瘤细胞系中普遍存在等位基因特异的DNA甲基化(ASM)。为了明确这些ASM的具体特征,我们在多种肿瘤细胞系中进行了RRBS检测和数据分析,同时比较了3个公开的人类胎盘RRBS数据,结果发现这些ASM除了已知的印记基因和X染色体失活相关的区域外,存在着大量的功能未知的基因组区域。但是,与胎盘中的结果不同,不同肿瘤细胞中的这些ASM没有共同性,提示其可能只是肿瘤DNA甲基化谱式紊乱的一种表现。为了进一步分析ASM产生和维持的分子机制,我们在肿瘤细胞系中改变维持性或起始性的DNA甲基化系统,包括过表达UHRF1、抑制表达UHRF1和过表达DNMT3A,并引入了DNMT3A基因与组蛋白互作结构域的突变体。通过RRBS检测结合数据分析流程,我们发现UHRF1对于ASM的维持是必须的,而新ASM的产生则需要DNMT3A介导,这种介导与DNMT3A结合组蛋白未修饰H3K4有关。当DNMT3A突变体结合甲基化的H3K4或者不结合H3K4时,产生的新ASM显著增多,推测是导致了起始性的DNA甲基化所致。最后,我们结合了肿瘤细胞RNAseq的基因表达数据,发现肿瘤细胞中的这些ASM与基因表达无明显的相关性。综合以上结果,肿瘤细胞中新发现的ASM与DNA甲基化维持和起始系统相关,但是不具有明确的调控基因表达功能,各种肿瘤细胞特异性极大,可能是肿瘤细胞DNA甲基化谱式紊乱的一种新的特征,是DNA甲基化化酶功能不足的一种表现,进一步的分子机制可以结合临床肿瘤样本开展。综上所述,本研究开发并完善了RRBS检测的数据分析流程,发现DNMT3A在肿瘤细胞中参与DNA甲基化谱式异常调控的证据；同时发现了肿瘤细胞系中大量新的ASM,并对他们的特征与功能进行了初步分析。本研究建立的分析流程可以应用到更多的DNA甲基化调控机制研究中去,本研究的结果可以为进一步阐明肿瘤细胞中DNA甲基化谱式紊乱的分子机制提供帮助。
【关键词】：RRBS 肿瘤 DNA甲基化 DNMT3A UHRF1 ASM
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.2
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-14
• 第一章 文献综述14-22
• 1 DNA甲基化研究进展14-16
• 1.1 DNA甲基化14-15
• 1.2 DNA甲基化酶15
• 1.3 DNA去甲基化15-16
• 2 DNA甲基化检测方法16-18
• 2.1 高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)17
• 2.2 免疫共沉淀法17
• 2.3 基于重亚硫酸盐处理法17-18
• 3 DNA甲基化数据分析18-21
• 3.1 DNA甲基化数据比对18-19
• 3.2 差异甲基化分析及可视化19-21
• 4 研究目的与意义21-22
• 第二章 RRBS传统分析流程的建立及其在A549过表达DNMT3A的RRBS数据分析中的应用22-43
• 1 引言22-23
• 2. 实验材料23-24
• 2.1 细胞株23
• 2.2 实验试剂或试剂盒23-24
• 2.3 实验仪器24
• 3 实验和数据分析方法24-32
• 3.1 RRBS文库的构建24-29
• 3.1.1 细胞基因组DNA的提取24
• 3.1.2 MSPI酶切反应24
• 3.1.3 使用Axygen PCR清洁试剂盒纯化24-25
• 3.1.4 末端修复25
• 3.1.5 3'端加A25
• 3.1.6 使用Axygen PCR清洁试剂盒纯化25-26
• 3.1.7 加甲基化接头26
• 3.1.8 琼脂糖电泳26-27
• 3.1.9 割胶回收27
• 3.1.10 重亚硫酸氢盐转化27-28
• 3.1.11 PCR扩增28
• 3.1.12 磁珠纯化28-29
• 3.1.13 上机测序29
• 3.2 数据分析流程29-32
• 3.2.1 测序质量评估30
• 3.2.2 序列比对30-31
• 3.2.3 胞嘧啶甲基化的统计31-32
• 3.2.4 CpG的注释32
• 4 结果32-42
• 4.1 质量控制32-34
• 4.2 基本的数据统计34-35
• 4.3 不同样品CpG覆盖度及甲基化分布35-38
• 4.4 两组样品CpG在功能元件上的注释38-39
• 4.5 落在不同重复序列的CpG的甲基化情况39-40
• 4.6 差异甲基化区域(DMR)分析40-42
• 5 小结42-43
• 第三章 RRBS深入分析流程的建立及其在不同肿瘤细胞中等位基因特异甲基化分析的应用43-68
• 1 引言43-44
• 2 实验材料44
• 3 实验和数据分析方法44-46
• 3.1 RRBS文库构建44
• 3.2 数据分析方法44-46
• 3.2.1 RRBS数据的ASM分析45-46
• 3.2.2 RRBS数据的SNP分析46
• 3.2.3 SNP与ASM的连锁分析46
• 3.2.4 ASM与基因表达的相关性分析46
• 4 结果46-67
• 4.1 知印记基因ASM与X染色体失活分析46-51
• 4.2 SNP分析验证分析ASM方法的可靠度51-54
• 4.3 肿瘤细胞系中ASM存在较大差异54-56
• 4.4 细胞中ASM的维持与UHRF1有关56-62
• 4.5 细胞中ASM的产生与DNMT3A有关62-66
• 4.6 细胞中ASM与基因表达无关66-67
• 5 小结67-68
• 第四章 总结与讨论68-71
• 攻读学位期间待发表论文71-72
• 参考文献72-78
• 附录1 代码78-90
• 1 CpG在不同特征区域上的注释78-79
• 2 CpG在重复序列上的注释79-81
• 3 计算每个reads的平均甲基化81-82
• 4 计算每个区段甲基化标准差82-84
• 5 不同区段在已知ASM上的注释84-86
• 6 提取每个reads甲基化表型86-87
• 7 提取目的片段甲基化表型87-88
• 8 ASM在不同特征区域上的注释88-90
• 致谢90

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