MARVELD1与核仁素相互作用及其与DNA损伤关系的研究

发布时间：2017-08-21 18:43

  本文关键词：MARVELD1与核仁素相互作用及其与DNA损伤关系的研究

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【摘要】：癌症的发生与癌基因、抑癌基因以及其他相关基因具有十分密切的关系。MARVELD1基因是本实验室在前期研究中发现的一个新的抑癌基因。MARVELD1(MARVEL domain containing 1)基因因含MARVEL(MAL and related proteins for vesicle trafficking and membrane link)结构域,故定名为MARVELD1。研究结果表明,MARVELD1具有抑制肿瘤增殖并导致细胞周期阻滞等作用,与多种基因和蛋白具有相互作用。前期研究结果显示,MARVELD1蛋白可能与核蛋白核仁素(Nucleolin,C23)具有相互作用。MARVELD1与核仁素均为定位于细胞核的蛋白,并且都参与了DNA损伤修复。本文以诱导DNA损伤为切入点,选用多种实验方法从不同角度研究分析了MARVELD1与核仁素的相互作用情况及二者的关系。首先,本文采用人宫颈癌细胞系He La细胞完成了MARVELD1与核仁素的共定位分析,进而,研究利用免疫共沉淀(Co-IP)技术和GST pull-down技术确认了MARVELD1与核仁素的相互作用,并通过重组体技术构建核仁素的重组截短体,明确了二者的结合结构域。随后,本文采用Western Blotting技术探讨MARVELD1与核仁素在诱导DNA损伤后的表达变化。最后,本文还通过亚细胞成分分离技术及si RNA干扰技术,研究了MARVELD1对核仁素亚细胞定位的影响。结果表明,MARVELD1与核仁素在DNA损伤以后共定位非常明显,二者确实具有相互作用,并且此相互作用在DNA损伤修复过程中有一个动态变化过程。MARVELD1与核仁素在DNA损伤修复过程中的表达趋势不一致,核仁素表达增高时MARVELD1已经开始表达下降。干扰MARVELD1结果表明,MARVELD1对核仁素亚细胞定位有一定影响。综上所述,本文确认了MARVELD1与核仁素的相互作用情况并明确了二者的结合结构域,研究显示了二者对DNA损伤都有明显响应,说明MARVELD1与核仁素在DNA损伤修复过程中具有一定作用,且二者有一定相互作用关系,这种关系可能是通过MARVELD1影响核仁素的亚细胞定位来实现的。
【关键词】：MARVELD1 核仁素 DNA损伤修复 蛋白质相互作用 亚细胞定位
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第1章 绪论9-22
• 1.1 课题背景及目的和意义9-10
• 1.2 国内外研究现状及分析10-19
• 1.2.1 MAEVELD1 简介10-11
• 1.2.2 核仁素简介11-16
• 1.2.3 DNA损伤及修复简介16-19
• 1.2.4 本文的研究假设19
• 1.3 主要研究内容19-21
• 1.4 课题来源21-22
• 第2章 材料与方法22-35
• 2.1 实验材料22-26
• 2.1.1 细胞系、载体及菌株22
• 2.1.2 抗体22-23
• 2.1.3 实验试剂及材料23
• 2.1.4 试剂及配方23-25
• 2.1.5 实验分析软件25
• 2.1.6 PCR 扩增引物及 RNAi 片段序列25
• 2.1.7 主要仪器设备25-26
• 2.2 实验方法26-35
• 2.2.1 细胞的传代培养26-27
• 2.2.2 细胞转染27
• 2.2.3 全细胞蛋白提取27-28
• 2.2.4 细胞浆和细胞核蛋白提取28
• 2.2.5 RNA提取28
• 2.2.6 逆转录合成cDNA28-29
• 2.2.7 pGEX-4T-2/Nucleolin重组体构建系列方法29-31
• 2.2.8 CaCl2 化学法感受态细胞制备31-32
• 2.2.9 GST融合蛋白诱导表达32
• 2.2.10 Western Blot免疫印记杂交32-33
• 2.2.11 免疫荧光实验33
• 2.2.12 免疫共沉淀（Co-IP）33-34
• 2.2.13 GST-pulldown34-35
• 第3章 MARVELD1 与核仁素的相互作用分析35-45
• 3.1 引言35
• 3.2 GST-MARVELD1 与核仁素相互作用分析35-36
• 3.3 Co-IP检测MARVELD1 与核仁素的相互作用36-38
• 3.3.1 MARVELD1 与核仁素免疫共沉淀36-37
• 3.3.2 核仁素与MARVELD1 免疫共沉淀37-38
• 3.4 GST-Nucleolin重组体构建及诱导表达38-42
• 3.4.1 pGEX-4T2Nucleolin重组体构建38-39
• 3.4.2 pGEX-4T2Nucleolin重组体筛选及验证39-40
• 3.4.3 重组子质粒转化表达菌株及融合蛋白体外诱导表达40-42
• 3.5 GST-Nucleolin与MARVELD1 相互作用分析42
• 3.6 讨论42-43
• 3.7 本章小结43-45
• 第4章 DNA损伤修复中MARVELD1 与核仁素的关系45-54
• 4.1 引言45
• 4.2 MARVELD1 与核仁素的共定位分析45-47
• 4.3 DNA损伤修复中MARVELD1 与核仁素的表达情况分析47-51
• 4.3.1 UV诱导后MARVELD1 与核仁素的表达47-48
• 4.3.2 射线（IR）照射后MARVELD1 与核仁素的表达48-49
• 4.3.3 Etoposide诱导后MARVELD1 与核仁素的表达49-50
• 4.3.4 UV及Etoposide联合处理后MARVELD1 与核仁素的表达变化50-51
• 4.4 DNA损伤修复过程中MARVELD1 与核仁素结合情况变化51
• 4.5 讨论51-53
• 4.6 本章小结53-54
• 第5章 MARVELD1 对核仁素亚细胞定位的影响54-58
• 5.1 引言54
• 5.2 DNA损伤时核仁素亚细胞定位的改变54-56
• 5.2.1 UV诱导后核仁素亚细胞定位的改变54-55
• 5.2.2 UV及Etoposide联合处理后核仁素亚细胞定位的改变55-56
• 5.3 MARVELD1 表达沉默对核仁素亚细胞定位的影响56
• 5.4 讨论56-57
• 5.5 本章小结57-58
• 结论58
• 展望58-59
• 参考文献59-64
• 攻读学位期间发表的学术论文64-66
• 致谢66

【引证文献】

中国重要会议论文全文数据库 前1条

1 蒙国照;曾思恩;周英琼;李运千;肖胜军;;细胞表面核仁素表达下调抑制乳腺癌细胞生长[A];中华医学会病理学分会2010年学术年会日程及论文汇编[C];2010年

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本文编号：714521