跨膜衔接蛋白CBP及其棕榈酰化位点突变在CD59介导的T系白血病中信号转导的研究

发布时间：2017-08-22 09:41

  本文关键词：跨膜衔接蛋白CBP及其棕榈酰化位点突变在CD59介导的T系白血病中信号转导的研究

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【摘要】：目的探讨跨膜衔接蛋白CBP与GPI锚固蛋白CD59在T细胞信号转导通路中的作用,进一步研究CBP与CD59在信号传递中的相互关系及作用机制,为白血病的治疗方面提供了相关的实验基础。方法选取Jurkat细胞系作为研究对象,构建CBP-EGFP慢病毒载体和CBP棕榈酰化位点突变-EGFP慢病毒载体,建立了稳定表达CBP-EGFP/CBP-M-EGFP的细胞系。使用CD59单克隆抗体分别刺激各组细胞,采用免疫荧光化学技术检测CBP、CD59在细胞上的表达及定位关系;光学显微镜下观察细胞的基础生长状态;电镜观察细胞内细胞器的复杂程度及超微结构的变化。流式细胞术检测细胞的基本参数及凋亡情况;CCK8法检测细胞的增殖效率。Western Blot检测与CBP结合的抑制性酪氨酸激酶CSK以及TCR活化通路中重要的信号分子LCK、FYN、PLCG1及ZAP70的表达。实时定量PCR检测了转染后CBP基因的表达情况,同时检测了T细胞信号转导通路中重要信号分子CD59、CSK、LCK、PLCG1及GRB2的表达。结果①激光共聚焦结果显示:共聚焦显微镜可见CBP、CD59分子定位于细胞膜上;CD59抗体交联刺激后,CBP-EGFP组可见CBP分子和CD59分子均呈戒指环状或点簇状高亮荧光分布,且分布区域存在交叉重叠,而CBP-M-EGFP组CBP分子与CD59分子在部分细胞中均出现点簇状聚集现象,但两者并不重叠。②光镜下发现转染CBP-EGFP病毒的Jurkat细胞皱缩细胞增多,大小均一性较差,以小个头细胞为主,CBP-M-EGFP组细胞形态大小不一,但以大个头细胞多见。③电镜可见转染后细胞内细胞器较Jurkat细胞复杂,有两组均出现自噬体样团块,但CBP-EGFP组较多,同时核质比降低、胞核变小、不规则,部分细胞器有肿胀现象。④实时定量PCR显示,转染病毒后,CBP基因在CBP-EGFP组和CBP-M-EGFP组的表达均上调。与CBP结合的抑制性酪氨酸激酶CSK基因表达量在CBP-EGFP组上调,在CBP-M-EGFP组是下调的。CD59、CSK、LCK、PLCG1及GRB2在CBP-EGFP组是下调的,而在CBP-M-EGFP组的结果则是相反的。⑤Western Blot显示,与CBP结合的抑制性蛋白CSK的表达量是增加的,CD59单抗作用以后CSK的表达量进一步增加;在CBP-EGFP组TCR活化通路中蛋白LCK、FYN、ZAP70表达量均下降,而CBP-M-EGFP组则是上升的。⑥CCK8结果显示,转染CBP-EGFP病毒载体后,细胞的活性和增殖效率明显下降;而转染突变了棕榈酰化位点的病毒载体,细胞活性增加,增殖效率上升。⑦细胞凋亡结果显示,CBP-EGFP组中,主要为早期凋亡细胞,比例为40%左右,中晚期凋亡细胞的比例在15%左右,CBP-M-EGFP组中,早期凋亡细胞和中晚期凋亡细胞均存在,早期凋亡细胞比例为25%左右,中晚期凋亡细胞比例为12%左右;CD59抗体交联后,CBP-EGFP组细胞凋亡数目明显增加,随着交联时间的延长,凋亡数目逐渐增加,CBP-M-EGFP组随着交联时间的延长,凋亡数目逐渐减少。结论高表达CBP能有效抑制Jurkat细胞的增殖,突变CBP棕榈酰化位点后抑制效果明显下降,同时利用CD59抗体交联,证实CD59可借助棕榈酰基团使CBP分子磷酸化,向细胞内传递抑制信号,引起TCR活化通路中一系列相关分子的变化,为探讨CD59与CBP在T细胞信号转导通路中相互作用奠定了基础,为探索T系淋巴细胞白血病发病机制提供了一定的实验数据,同时也为临床T系白血病的诊断、防治提供了新的靶标。
【关键词】：CD59 CBP 信号转导 实时定量PCR 电镜
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.7
【目录】：

• 中文摘要2-4
• Abstract4-9
• 引言9-11
• 第一章 材料和方法11-26
• 1.1 材料11-13
• 1.1.1 主要实验仪器11
• 1.1.2 细胞株与病毒载体11-12
• 1.1.3 抗体12
• 1.1.4 其他主要试剂12-13
• 1.1.5 常用液体的配置13
• 1.2 方法13-26
• 1.2.1 Jurkat细胞培养13-15
• 1.2.1.1 细胞换液与细胞传代13-14
• 1.2.1.2 细胞冻存与细胞复苏14-15
• 1.2.2 Jurkat细胞病毒转染及转染效率的测定15-17
• 1.2.2.1 病毒转染流程15-16
• 1.2.2.2 病毒转染效率的测定16
• 1.2.2.3 稳定细胞系的建立16-17
• 1.2.3 激光共聚焦显微镜观察细胞内CD59与CBP的定位17
• 1.2.4 透射电镜17-18
• 1.2.5 实时定量PCR18-21
• 1.2.5.1 各细胞系总RNA的提取与纯化18-19
• 1.2.5.2 cDNA的合成19
• 1.2.5.3 Real-time q PCR反应19-21
• 1.2.6 Western Blot21-23
• 1.2.6.1 总蛋白的提取21
• 1.2.6.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳21-23
• 1.2.6.3 转膜23
• 1.2.6.4 孵育抗体及检测23
• 1.2.7 功能检测23-25
• 1.2.7.1 CD59单克隆抗体交联处理细胞23-24
• 1.2.7.2 细胞增殖试验24
• 1.2.7.3 细胞凋亡试验24-25
• 1.2.8 统计学分析25-26
• 第二章 结果26-42
• 2.1 Jurkat细胞的培养26
• 2.2 Jurkat细胞病毒转染26-30
• 2.2.1 相差显微镜观察转染细胞26-27
• 2.2.2 激光共聚焦显微镜观察病毒转染效率27-28
• 2.2.3 激光共聚焦显微镜观察抗体作用前后CBP的定位28-29
• 2.2.4 激光共聚焦显微镜观察CD59与CBP的定位及关系29-30
• 2.3 电镜观察细胞内的超微结构30-31
• 2.4 实时定量PCR检测T细胞信号转导基因的表达31-35
• 2.4.1 CBP与抑制性酪氨酸激酶CSK基因的表达32-33
• 2.4.2 TCR活化通路中重要的信号分子基因的表达33-35
• 2.5 Western Blot35-37
• 2.5.1 抑制性酪氨酸激酶CSK与LCK的表达35-36
• 2.5.2 TCR活化通路中重要的信号分子的表达36-37
• 2.6 功能检测37-42
• 2.6.1 CCK8检测Jurkat细胞增殖37-38
• 2.6.2 流式细胞术检测Jurkat细胞凋亡38-42
• 2.6.2.1 流式细胞术检测细胞的物理参数38
• 2.6.2.2 流式细胞术检测细胞凋亡38-42
• 第三章 讨论42-46
• 3.1 跨膜蛋白 CBP 是在 T 淋巴细胞信号转导通路中起到抑制作用42-44
• 3.2 GPI 锚固蛋白 CD59 借棕榈酰化基团与 CBP 共同调节 T 淋巴细胞信号转导44-46
• 结论46-47
• 参考文献47-49
• 综述49-63
• 参考文献58-63
• 攻读学位期间的研究成果63-64
• 附录64-67
• 致谢67-68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 褚波;黄雪峰;唐云明;;慢病毒载体及其应用进展[J];生物医学工程学杂志;2008年01期

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本文编号：718422