结肠腺瘤息肉蛋白N端片段影响纤毛形成和细胞粘附的机制研究

发布时间：2017-08-22 19:02

  本文关键词：结肠腺瘤息肉蛋白N端片段影响纤毛形成和细胞粘附的机制研究

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【摘要】：Adenomatous Polyposis Coli,即结肠腺瘤息肉蛋白,简称APC,参与Wnt信号通路、细胞迁移、粘附、细胞极性、染色体正常分离等。纤毛是突出于细胞表面的一种亚细胞结构。纤毛形成受损或结构异常与多种疾病的发生相关。细胞粘附包括细胞间粘附和细胞基质间粘附,是恶性肿瘤始动转移的关键。已有研究表明APC突变与纤毛形成受损和细胞粘附异常相关,但具体机制还不清楚。在多数APC突变的个体中都保留有其N端1至448个氨基酸的片段(命名为APC-N1),这一片段包括一个寡聚结构域,导致APC同源二聚体结构的形成,从而使蛋白失去活性。本课题主要对APC-N1片段影响纤毛形成和细胞粘附的机制进行研究,研究内容包括以下几部分：第一部分：首先利用荧光定量PCR和Western印迹方法检测了MDCK-GFP和MDCK-APC-N1稳定细胞株的Hedgehog信号通路中两个主要成员Ptchl和Glil的表达情况。结果显示,与对照MDCK-GFP细胞相比,MDCK-APC-N1细胞中Ptchl和Glil的表达上调,表明过表达APC-N1激活Hedgehog信号通路。分别利用RNA干扰技术和抑制剂GANT61处理MDCK-APC-N1细胞,发现当Glil表达量降低时,细胞纤毛形成率显著升高,表明过表达APC-N1是通过Hedgehog信号通路影响MDCK细胞纤毛形成。进一步利用RNA干扰技术敲减MDCK-APC-N1细胞中β-catenin,发现敲减β-catenin导致Gli1的表达量降低。以上结果表明APC-N1通过p-catenin影响Hedgehog信号通路,进而抑制纤毛形成。第二部分：利用荧光定量PCR检测AurA的mRNA表达水平,发现AurA表达上调。分别通过RNA干扰技术和TSA药物处理敲减AurA和抑制HDAC6表达,结果发现当AurA或HDAC6表达降低时,纤毛形成率明显增加,表明过表达APC-N1是通过上调AurA/HDAC6表达而抑制纤毛形成。利用RNA干扰技术敲减Glil检测AurA和HDAC6表达变化情况,结果发现Glil表达降低时,AurA和HDAC6表达量减少。这些结果表明,过表达APC-N1通过激活Hedgehog信号通路使AurA/HDAC6表达量上调,进而抑制纤毛形成。第三部分：利用细胞间粘附实验、荧光定量PCR、Western印迹检测APC-N1对细胞间粘附和相关粘附分子E-cadherin的影响,结果发现APC-N1降低细胞-细胞间粘附和E-cadherin的表达。利用结晶紫染色、荧光定量PCR, Western印迹检测APC-N1对细胞基质间粘附和相关粘附分子CD29的影响,结果发现APC-N1过表达提高细胞-基质间粘附能力和CD29的表达。利用RNA干扰技术敲减β-catenin导致E-cadherin表达上调却对CD29没有明显影响,表明APC-N1通过β-catenin影响E-cadherin的表达。LY294002药物处理MDCK-APC-N1细胞检测E-cadherin和CD29的表达情况,结果显示P-AKT(T308)蛋白水平减少,E-cadherin表达量上调,CD29表达降低。以上结果表明APC-N1通过PI3K/AKT信号通路影响细胞粘附。综上所述,本研究探讨了APC-N1影响纤毛形成和细胞粘附的机制,结果表明APC-N1通过β-catenin激活Hedgehog信号通路,进而上调AurA/HDAC6表达,导致纤毛形成受损；此外,APC-N1通过PI3K/AKT信号通路影响细胞粘附。
【关键词】：结肠腺瘤息肉蛋白 Hedgehog信号通路 AurA HDAC6 纤毛 细胞粘附 PI3K/AKT信号通路
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.35
【目录】：

• 中文摘要12-14
• ABSTRACT14-16
• 第一章 文献综述16-29
• 1.1 结肠腺瘤息肉蛋白16-18
• 1.1.1 结肠腺瘤息肉蛋白的结构及其氨基酸序列组成16-17
• 1.1.2 结肠腺瘤息肉蛋白的功能17-18
• 1.1.3 结肠腺瘤息肉蛋白突变与相关疾病18
• 1.2 纤毛18-21
• 1.2.1 纤毛的结构及组装解聚18-19
• 1.2.2 纤毛的功能19-20
• 1.2.3 纤毛与Hedgehog信号通路20-21
• 1.3 结肠腺瘤息肉蛋白、Hedgehog信号通路和纤毛21-22
• 1.4 细胞粘附22-23
• 1.4.1 细胞粘附简介22-23
• 1.4.2 PI3K/AKT信号通路和细胞粘附23
• 1.5 结肠腺瘤息肉蛋白和细胞粘附23-24
• 1.6 研究目的及意义24
• 参考文献24-29
• 第二章 APC-N1通过β-catenin激活Hedgehog信号通路进而抑制纤毛形成29-42
• 2.1 实验材料29-31
• 2.1.1 细胞株和质粒29-30
• 2.1.2 抗体及实验试剂30-31
• 2.2 实验方法31-34
• 2.2.1 MDCK细胞的培养31
• 2.2.2 MDCK细胞的复苏31
• 2.2.3 MDCK细胞的冻存31-32
• 2.2.4 RNA干扰32
• 2.2.5 抑制剂GANT61药物处理32
• 2.2.6 总RNA提取及反转录32-33
• 2.2.7 荧光定量PCR33
• 2.2.8 总蛋白提取33
• 2.2.9 Western印迹33-34
• 2.2.10 免疫荧光染色34
• 2.2.11 统计学分析34
• 2.3 实验结果34-40
• 2.3.1 APC-N1片段过表达激活Hedgehog信号通路34-36
• 2.3.2 APC-N1通过Hedgehog信号通路抑制纤毛的生长36-38
• 2.3.3 APC-N1通过β-catenin激活Hedgehog信号通路38-40
• 2.4 讨论40
• 参考文献40-42
• 第三章 APC-N1通过Hedgehog信号通路调节AurA/HDAC6进而抑制纤毛生长42-50
• 3.1 实验材料42-43
• 3.1.1 细胞株和质粒42
• 3.1.2 抗体及试剂42-43
• 3.2 实验方法43-44
• 3.2.1 MDCK-APC-N1细胞的培养43
• 3.2.2 MDCK-APC-N1细胞的复苏43
• 3.2.3 MDCK-APC-N1细胞的冻存43
• 3.2.4 抑制剂TSA药物处理43
• 3.2.5 RNA干扰43
• 3.2.6 总RNA提取及反转录43
• 3.2.7 免疫荧光染色43
• 3.2.8 荧光定量PCR43-44
• 3.2.9 总蛋白提取及Western印迹44
• 3.2.10 统计学分析44
• 3.3 实验结果44-47
• 3.3.1 APC-N1通过上调AurA和HDAC6影响纤毛形成44-46
• 3.3.2 APC-N1通过Hedgehog信号通路调节AurA和HDAC6进而抑制纤毛形成46-47
• 3.4 讨论47-48
• 参考文献48-50
• 第四章 APC-N1对犬肾细胞MDCK细胞粘附的影响50-61
• 4.1 实验材料50-51
• 4.1.1 细胞株和质粒50
• 4.1.2 抗体及试剂50-51
• 4.2 实验方法51-52
• 4.2.1 MDCK-APC-GFP、MDCK-APC-N1细胞的培养、复苏、冻存51
• 4.2.2 抑制剂LY294002药物处理51
• 4.2.3 细胞聚集实验51
• 4.2.4 细胞-基质粘附实验51
• 4.2.5 RNA干扰51
• 4.2.6 总RNA提取及反转录51
• 4.2.7 荧光定量PCR51-52
• 4.2.8 总蛋白提取及Western印迹52
• 4.2.9 统计学分析52
• 4.3 实验结果52-56
• 4.3.1 APC-N1过表达对MDCK细胞间粘附和E-cadherin表达的影响52-53
• 4.3.2 APC-N1过表达对MDCK细胞基质间粘附和CD29表达的影响53-55
• 4.3.3 APC-N1通过β-catenin影响E-cadherin表达55
• 4.3.4 APC-N1通过PI3K/AKT信号通路影响E-cadherin和CD29的表达55-56
• 4.4 讨论56-57
• 参考文献57-61
• 结论与讨论61-63
• 附录1 英文缩略语表63-65
• 附录2 主要试剂配制65-67
• 附录3 实验主要仪器设备67-68
• 攻读学位期间取得的研究成果68-69
• 致谢69-70
• 个人简历及联系方式70-71
• 承诺书71-72

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 李斌;王济明;;组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)与肿瘤[J];临床和实验医学杂志;2006年12期

2 李文玲;祝文思;牛海波;朱峰;宋莉;李卓玉;;腺瘤性结肠息肉(APC)蛋白截短突变对MDCK细胞中细胞-基质和细胞-细胞间黏附的影响(英文)[J];复旦学报(医学版);2013年02期

3 戴文斌;;Wnt通路成员APC、β-catenin、c-myc及黏附分子E-cadherin与大肠癌的关系[J];中国肿瘤临床与康复;2007年01期

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本文编号：720826