结肠癌干细胞抗原致敏的树突状细胞诱导抗肿瘤免疫应答的研究

发布时间：2017-08-29 21:34

  本文关键词：结肠癌干细胞抗原致敏的树突状细胞诱导抗肿瘤免疫应答的研究

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【摘要】：目的结肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一。目前，外科切除联合化疗和/或放射治疗仍然是针对结肠癌的主要治疗方法，但是仍有很高的肿瘤复发率。虽然辅助放化疗能够在一定程度上延长患者的生存期，但同时也伴随着严重的副作用，因此急需发展更有效的治疗结肠癌的策略。近年来，临床前数据表明肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）起始了肿瘤的生长并且是肿瘤自我更新、分化、复发和转移以及放化疗耐受性的关键。根据肿瘤干细胞（CSC）理论，只有靶向清除CSC，才有可能治愈肿瘤。因此，本文以CD44为筛选标志，从小鼠结肠癌细胞系CT-26中分选出CD44+细胞作为小鼠结肠癌干细胞，探讨CD44+CT-26细胞裂解物和总RNA致敏的树突状细胞（dendritic cell，DC）是否能诱导靶向肿瘤干细胞的抗肿瘤免疫应答。 方法用免疫磁珠法分离获得CD44+CT-26细胞，用含20ng/ml bFGF、20ng/mlEGF、2%B27的无血清DMEM/F12培养基培养扩增。将CD44+CT-26的细胞裂解物或总RNA分别作为抗原负载小鼠骨髓来源的DC，获得Pro-DC和RNA-DC疫苗，免疫接种有CD44+CT-26细胞的BALB/c小鼠，进行免疫保护实验和免疫治疗实验，每2-3天测量肿瘤大小并观察瘤体生长及小鼠存活情况。取小鼠的脾脏，体外检测T细胞的细胞毒性以及IFN-γ分泌能力。 结果（1）免疫保护组：与PBS组和未致敏DC组相比，Pro-DC组和RNA-DC组的成瘤时间延迟且肿瘤生长缓慢，尤其是Pro-DC组在接种后第15天仍未长出肿瘤。Pro-DC组和RNA-DC组的肿瘤重量显著低于对照组和未致敏DC组（P0.05）；生存周期分析发现，Pro-DC和RNA-DC组小鼠的生存期显著长于PBS组和未致敏DC组（P0.05），第50天时未致敏DC组和PBS组小鼠已经全部死亡，至第60天实验结束时，Pro-DC组和RNA-DC组的生存率分别为60%和50%；Pro-DC和RNA-DC组CTL对CD44+CT-26的杀伤作用及细胞上清液中IFN-γ的分泌量显著高于PBS组和未致敏DC组（P0.05）；另外，与RNA-DC相比，Pro-DC的免疫保护作用更加显著（P0.05）。（2）免疫治疗组：与PBS组和未致敏DC组相比，经Pro-DC和RNA-DC治疗后，肿瘤的生长受到了显著的抑制。实验结束时，Pro-DC组和RNA-DC组的肿瘤重量显著低于对照组和未致敏DC组（P0.05）；Pro-DC和RNA-DC组小鼠的生存期显著长于PBS组和未致敏DC组（P0.05），第50天时未致敏DC组和PBS组小鼠已经全部死亡，至第60天实验结束时，Pro-DC组和RNA-DC组的生存率分别为60%和10%；Pro-DC或RNA-DC组CTL对CD44+CT-26的杀伤作用以及细胞上清液中IFN-γ的分泌量显著高于PBS组和未致敏DC组（P0.05）；另外，与RNA-DC相比，Pro-DC的免疫治疗作用更加显著（P0.05）。 结论（1）免疫保护组：Pro-DC和RNA-DC疫苗的免疫诱导机体产生了有效的免疫保护作用，能够延缓肿瘤出现，抑制肿瘤的生长，并且显著延长荷瘤小鼠的生存时间。另外，Pro-DC和RNA-DC诱导机体产生了特异性CTL，，对CT-26肿瘤干细胞有显著的杀伤作用，同时分泌较高水平的IFN-γ。并且与RNA-DC相比，Pro-DC的免疫保护作用更加显著。（2）免疫治疗组：Pro-DC和RNA-DC能够诱导有效的抗肿瘤免疫，且Pro-DC的免疫治疗效果优于RNA-DC。综上所述，CT-26肿瘤干细胞裂解物或总RNA负载的DC能够诱导靶向结肠癌干细胞的免疫应答，这为以结肠癌干细胞为靶向的DC疫苗的研究提供了新的思路。
【关键词】：树突状细胞 肿瘤干细胞 细胞毒性T淋巴细胞 结肠癌 免疫治疗
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.35
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 英文缩略词表11-12
• 第1章 绪论12-26
• 1.1 结肠癌的简介12
• 1.2 肿瘤干细胞12-15
• 1.2.1 肿瘤干细胞理论12-13
• 1.2.2 靶向肿瘤干细胞的治疗13-15
• 1.3 结肠癌干细胞15-17
• 1.3.1 结肠癌干细胞的分选15-16
• 1.3.2 结肠癌干细胞的鉴定16-17
• 1.4 DC 的简介17-21
• 1.4.1 DC 的体内分布及来源17-18
• 1.4.2 DC 在免疫应答中的作用18-20
• 1.4.3 不同细胞因子对DC体外培养的作用20-21
• 1.4.4 DC 与肿瘤的关系21
• 1.5 DC 肿瘤疫苗21-26
• 1.5.1 肿瘤疫苗的生物学特点21-22
• 1.5.2 以DC为基础的肿瘤疫苗22-24
• 1.5.3 DC 肿瘤疫苗的临床应用24
• 1.5.4 DC 肿瘤疫苗的安全性24-26
• 第2章 材料与方法26-30
• 2.1 研究对象26
• 2.1.1 细胞系26
• 2.1.2 实验动物26
• 2.2 主要仪器26-27
• 2.3 主要试剂27-28
• 2.4 主要试剂配制28-30
• 第3章 实验方法30-37
• 3.1 小鼠结肠癌干细胞的分离培养30-32
• 3.1.1 免疫磁珠法筛选结肠癌干细胞30-31
• 3.1.2 结肠癌干细胞的培养31
• 3.1.3 结肠癌干细胞的鉴定31-32
• 3.2 结肠癌干细胞抗原的制备32-33
• 3.2.1 反复冻融法获得结肠癌干细胞完全抗原32
• 3.2.2 结肠癌干细胞总RNA的提取32-33
• 3.3 树突状细胞（DC）疫苗的制备33
• 3.3.1 DC 的分离培养33
• 3.3.2 DC 疫苗的制备33
• 3.4 负载结肠癌干细胞抗原的 DC 疫苗的免疫保护实验33-34
• 3.5 负载结肠癌干细胞抗原的 DC 疫苗的免疫治疗实验34
• 3.6 CTL对结肠癌干细胞的杀伤作用34-36
• 3.6.1 T 淋巴细胞的分离培养34-35
• 3.6.2 CTL 对结肠癌干细胞的杀伤作用35
• 3.6.3 IFN-γ的检测35-36
• 3.7 统计学分析36-37
• 第4章 实验结果37-49
• 4.1 小鼠结肠癌干细胞的分离培养及鉴定37-39
• 4.1.1 小鼠结肠癌干细胞的分离培养37
• 4.1.2 小鼠结肠癌干细胞的鉴定37-39
• 4.2 DC 的分离培养39
• 4.3 小鼠肿瘤干细胞抗原致敏的 DC 诱导产生的免疫保护作用39-44
• 4.3.1 小鼠肿瘤的生长情况39-41
• 4.3.2 小鼠的生存时间41-42
• 4.3.3 CTL 对结肠癌干细胞的杀伤作用42-43
• 4.3.4 CTL的IFN-γ分泌43-44
• 4.4 小鼠肿瘤干细胞抗原致敏的 DC 诱导产生的免疫治疗作用44-49
• 4.4.1 小鼠肿瘤的生长情况44-46
• 4.4.2 小鼠的生存时间46
• 4.4.3 CTL 对结肠癌干细胞的杀伤作用46-47
• 4.4.4 CTL 的 IFN-γ分泌47-49
• 第5章 讨论49-52
• 第6章 结论52-53
• 参考文献53-62
• 作者简介及攻读学位期间发表研究成果62-63
• 致谢63

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 刘红艳;郭静明;王海燕;冉昌丽;叶松;潘丽萍;;DCs诱导特异性CTL抗非霍奇金淋巴瘤作用的研究[J];现代肿瘤医学;2012年05期

2 汪路;孟庆勇;王小军;郑榜祥;;结肠癌根治术后复发转移危险因素分析[J];中国肿瘤;2007年08期

3 陈琼;刘志才;程兰平;宋国慧;孙喜斌;郑荣寿;张思维;陈万青;;2003～2007年中国结直肠癌发病与死亡分析[J];中国肿瘤;2012年03期

本文编号：755563