CD20嵌合抗原受体修饰自体T细胞对B细胞淋巴瘤的杀伤作用研究

发布时间：2017-08-30 12:15

  本文关键词：CD20嵌合抗原受体修饰自体T细胞对B细胞淋巴瘤的杀伤作用研究

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【摘要】：目的：B淋巴瘤细胞表达的CD20抗原是公认的治疗靶点。但CD20抗体血清半衰期短,易耐药,不能将肿瘤细胞彻底杀灭。近期实验证实CD28、CD137可激活体外培养的T细胞,使其恢复体内增殖能力和抗肿瘤能力。本课题将CD20抗体与CD28、CD137抗体组成嵌合抗原受体,转染并激活自体T细胞,使其对淋巴瘤细胞同时具有靶向杀伤和免疫监控作用。方法：利用基因合成技术合成CD20-28-137-TCR-ζ基因序列,送至基因测序公司进行检测,比对基因序列图谱,检测基因合成的正确性。构建慢病毒载体,将合成好的基因序列载入到慢病毒载体中。用COBE细胞单采机采集淋巴瘤患者的外周血细胞,用淋巴细胞分离液分离,采用培养CIK细胞的方法对淋巴细胞进行培养,加入CD3, IFN-γ, IL-2细胞因子,刺激T细胞增长,以得到较为纯净的目的T细胞。用之前构建的高效稳定的慢病毒载体转染目的T细胞,合成CAR-T-20细胞,留作之后试验检测。采用LDH法测定CAR-T细胞的细胞外毒性。将CAR细胞与淋巴瘤细胞按照一定的比例混合,检测CAR-T细胞对淋巴瘤细胞是否具有杀伤作用,并判断CAR-T与淋巴细胞具有最大杀伤作用的比例为多少。构建淋巴瘤小鼠模型,将构建好的CAR-T细胞注入小鼠体内,观察记录小鼠体内肿瘤的大小变化,并作出记录进行统计,以判断CAR-T在体内对淋巴瘤的杀伤作用。结果：经过基因测序检测合成的CD20-28-137-TCR-ζ基因与目标基因序列一致,长度相同,说明基因构建成功。构建后的慢病毒载体,经琼脂糖凝胶电泳检测条带清晰,位置相同,说明CA20-28-137-TCR-ζ基因被成功载入慢病毒载体中。之后对慢病毒载体进行包装和滴度测定,通过GFP检测观察慢病毒载体被成功包装,慢病毒的滴度经过计算结果为8.25×108TU/ML。用慢病毒载体转染目的T细胞,根据转染前后目的T细胞的细胞数量得出,转染效率为56%。LDH试验共按照四个比例进行比对,比对结果发现在CAR-T细胞与淋巴瘤细胞的比例在10：1的情况下,对淋巴瘤的杀伤作用最大。构建的小鼠模型按照每组10只,分成3个组,分别是空白对照组,阴性对照组和阳性对照组,实验结果观察到的数据显示阳性对照组对肿瘤的生长具有明显抑制作用,阴性对照组和空白对照组的肿瘤生长速度差距不大。结论：体外实验充分证实CAR-T细胞对淋巴瘤具有杀伤作用,且在CAR-T细胞与淋巴瘤细胞比值在10：1的情况下,杀伤作用最大。体内试验初步证明了CAR-T细胞对淋巴瘤的生长具有一定抑制作用。综上所述,初步证明CAR-T细胞对B细胞淋巴瘤的治疗具有一定的治疗效果。
【关键词】：嵌合抗原受体 B细胞淋巴瘤 慢病毒载体 转染
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.1
【目录】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-12
• 绪论12-20
• (1) B淋巴瘤的发病率及国内外的治疗现状12-13
• (2) 淋巴瘤药物的治疗缺陷13
• (3) 细胞免疫对B细胞淋巴瘤的作用13-14
• (4) 特异性抗原CD2014-15
• (5) 共刺激分子CD28,CD13715-16
• (6) 嵌合抗原受体CAR及其研究进展16-17
• (7) 近些年国内外取得的研究进展和临床实验结果17-18
• (8) 临床应用中出现的不良反应与风险18-19
• (9) 研究设想及主要研究方法19-20
• 缩略词表20-22
• 材料与方法22-32
• 一、实验动物22
• 二、主要仪器与设备22-23
• 三、主要实验试剂及材料23-24
• 四、实验方法24-32
• 统计学方法32-33
• 实验结果33-42
• 1. T细胞的培养33-34
• 2. 慢病毒载体的构建34
• 3. 琼脂糖凝胶电泳检测34-35
• 4. 测序比对验证结果35-36
• 5. 慢病毒载体的包装结果检测36-37
• 6. 病毒滴度测试结果37-39
• 7. 慢病毒转染目的T细胞39
• 8. LDH检测细胞外毒性39-40
• 9. 动物实验40-42
• 讨论42-47
• 1. CAR-T的结构与功能42-44
• 2. 慢病毒载体44-45
• 3. 临床应用及展望45-47
• 全文结论47-48
• 参考文献48-55
• 综述55-64
• 参考文献60-64
• 致谢64-66
• 附录A 攻读硕士期间发表论文情况66-67
• 附录B 其他要说明的内容67

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本文编号：759238