不同转移潜能的膀胱细胞株的亚细胞结构蛋白的N-连接聚糖分布解析

发布时间：2017-08-30 14:06

  本文关键词：不同转移潜能的膀胱细胞株的亚细胞结构蛋白的N-连接聚糖分布解析

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【摘要】：膀胱细胞癌是一种常见的恶性肿瘤,它的发生与糖链的异常表达关系紧密。亚细胞结构蛋白的提取有利于低丰度蛋白的提取,降低研究细胞蛋白组学的复杂度。亚细胞结构糖组学的研究有助于了解亚细胞结构功能多样性的机理。本研究以一株肌层浸润性膀胱癌细胞系(YTS1),一株非肌层浸润性膀胱癌细胞系(KK47)和一株正常膀胱上皮细胞系(HCV29)为实验材料,使用改进的差速离心的方法获得了四类亚细胞结构(微粒体、线粒体、细胞核和细胞质)的蛋白质组分及其糖蛋白质糖链结构,利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)结合凝集素芯片的方法鉴定亚细胞结构蛋白的糖基化修饰类型和结构。1.通过改进的差速离心法可以高效提取YTS1、KK47、HCV29细胞的四种亚细胞结构蛋白,该结果通过SDS-PAGE,银染和Western blot技术得到验证。2. 比较了N-连接聚糖在四种亚细胞结构中的含量差异。凝集素芯片实验结果表明在YTS1的四种亚细胞结构中与凝集素LCA、AAL、MPL、WGA和PWM结合的糖链结构,在KK47的四种亚细胞结构中与凝集素STL、VVA、LCA、LTL、EEL和WGA结合的糖链结构,在HCV29的四种亚细胞结构中与凝集素ConA、GNA、VVA 和 ACA结合的糖链结构在不同亚细胞结构中差异显著。在YTS1中,凝集素LCA识别的N-连接聚糖含量在线粒体和细胞核的差异显著,凝集素AAL识别的N-连接聚糖含量在线粒体和细胞质差异显著,凝集素MPL识别的N-连接聚糖含量在细胞核和细胞质中差异显著。在KK47中,凝集素STL识别的N-连接聚糖含量在线粒体和细胞核中差异显著,凝集素AAL识别的N-连接聚糖含量在微粒体和细胞质中差异显著。在HCV29中,凝集素GNA识别的N-连接聚糖含量在微粒体和细胞核中差异显著。3. 比较了N-连接聚糖的不同糖型在四种亚细胞结构中的分布。质谱结果显示总共有40种、32种、15种N-连接聚糖在YTS1、KK47、HCV29两种细胞中被检测到。在YTS1、KK47、HCV29的四种亚细胞结构中高甘露糖型和岩藻糖化型是N-连接聚糖的主要糖型。YTS1、KK47、HCV29分别有10种、5种、7种N-连接聚糖出现在四种亚细胞结构中,分别有10种、17种、3种N-连接聚糖仅出现在一种亚细胞结构中,这些糖链结构可能作为特定细胞器的聚糖标志物。4. 建立并优化滤膜辅助的化学方法提取N-连接聚糖,并且在标准蛋白样品、血清水平和细胞水平得到验证。本研究率先在亚细胞结构水平上建立糖组学的研究方法,为阐释糖蛋白功能的多样性提供了理论依据。凝集素芯片技术结合质谱方法研究人膀胱非肌层浸润性膀胱癌细胞株KK47、人膀胱肌层浸润性癌细胞株YTS1、正常的人膀胱上皮细胞株HCV29的四种亚细胞结构聚糖的分布具有高分辨率和高灵敏性,有利于不同亚细胞结构的聚糖和相应的糖基化蛋白功能的研究。
【关键词】：亚细胞结构 N-连接聚糖 凝集素芯片 MALDI-TOF/TOF-MS
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.14
【目录】：

• 摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 1.前言11-16
• 1.1 膀胱细胞癌11
• 1.2 糖组学11-13
• 1.2.1 细胞蛋白质糖基化和主要类型11-12
• 1.2.2 N-连接聚糖的释放12
• 1.2.3 糖链的解析技术12-13
• 1.3 质谱技术在糖链分析中的应用13-14
• 1.3.1 质谱技术的原理13
• 1.3.2 应用质谱技术分析糖链结构13-14
• 1.4 凝集素芯片技术在糖组学中的应用14-15
• 1.4.1 凝集素芯片的原理14
• 1.4.2 应用凝集素芯片方法分析糖链结构14-15
• 1.5 亚细胞蛋白质组学研究15-16
• 1.6 研究目的和意义16
• 2. 材料与方法16-22
• 2.1 实验材料16-17
• 2.1.1 材料16
• 2.1.2 试剂16-17
• 2.1.3 仪器17
• 2.1.4 分析软件17
• 2.2 方法17-22
• 2.2.1 膀胱癌细胞培养17-18
• 2.2.2 细胞破碎以及总蛋白的提取18
• 2.2.3 亚细胞结构蛋白的提取和验证18-19
• 2.2.4 蛋白样品中糖链的释放19-20
• 2.2.5 初级N-糖糖链样品除盐20
• 2.2.6 N-糖糖链样品的MALDI-TOF-质谱解析20-21
• 2.2.7 凝集素芯片分析21-22
• 3. 结果与分析22-41
• 3.1 细胞器marker确定亚细胞结构蛋白分离效果22-23
• 3.2 基于凝集素芯片法YTS1、KK47、HCV29亚细胞结构糖蛋白的糖型分析23-29
• 3.3 YTS1、KK47、HCV29亚细胞结构的N-连接聚糖的质谱分析29-33
• 3.4 YTS1、KK47、HCV29亚细胞结构糖蛋白N-连接聚糖的糖型的相对比例差异33-36
• 3.5 糖链结构的确定和二级质谱图36-38
• 3.6 滤膜辅助的化学方法提取糖链38-41
• 4. 讨论与结论41-43
• 参考文献43-47
• 附录47-49
• 致谢49

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1 黄鲁瑜;不同转移潜能的膀胱细胞株的亚细胞结构蛋白的N-连接聚糖分布解析[D];福建农林大学;2016年

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本文编号：759721