XRCC3的表达对食管鳞癌细胞放疗敏感性的影响及其机制研究

发布时间：2017-08-31 04:43

  本文关键词：XRCC3的表达对食管鳞癌细胞放疗敏感性的影响及其机制研究

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【摘要】：目的:研究同源重组相关蛋白XRCC3的表达影响食管鳞状细胞癌放疗敏感性的分子机制。方法:1.采用RT-PCR及Western Blot法在m RNA和蛋白水平检测XRCC3在正常食黏膜细胞与食管鳞癌细胞的表达水平。通过免疫组织化学检测XRCC3在正常食管黏膜组织及食管鳞癌组织中的表达水平。采用免疫组化评分标准对60例食管鳞癌组织标本中XRCC3的表达情况进行评分。用单因素分析该60例患者一般情况(年龄、性别、TNM分期等)以及对放化疗的敏感性与XRCC3表达水平的相关性。运用单变量分析方法分析60例食管鳞癌患者XRCC3表达水平与疾病相关生存的相关性。采用多因素分析的统计学方法分析患者食管鳞癌组织XRCC3表达水平、患者对同步放化疗反应、N分期、M分期与患者疾病相关生存的相关性。2.将沉默XRCC3基因的质粒psh RNA-XRCC3转染至食管鳞癌TE-1细胞及Kyse30细胞,建立沉默XRCC3表达稳定细胞系,同时将过表达XRCC3基因的质粒p CDH-XRCC3转染至上述稳定细胞系中,建立XRCC3回复表达组,并设立未转染空白对照组,用Western Blot法检测psh RNA-XRCC3的沉默效率和p CDH-XRCC3回复表达效率。3.检测沉默XRCC3对克隆形成能力的影响。采用克隆形成实验检测沉默XRCC3组、回复XRCC3表达组以及空白对照组TE-1细胞和Kyse30细胞放疗后的克隆形成能力,观察放疗对各组细胞克隆形成能力的影响。沉默XRCC3表达的荷瘤裸鼠移植瘤(TE-1细胞)在经放疗后,采用游标卡尺动态检测裸鼠移植瘤体积的变化。4.采用流式细胞术检测沉默XRCC3组、回复XRCC3表达组以及空白对照组TE-1细胞和Kyse30细胞经不同剂量放疗后的凋亡水平,同时用高倍显微镜观察各组细胞有丝分裂灾难情况。采用Western Blot法检测各组放疗前后凋亡相关蛋白Cleaved-PARP和Cleaved-Casbase-3的表达水平,并检测各组细胞同源重组修复相关蛋白XRCC2和Rad51.3的表达情况。5.采用免疫荧光法分别检测沉默XRCC3组、回复XRCC3表达组以及空白对照组TE-1细胞和Kyse30细胞在放疗前后端粒功能紊乱诱导形成的TIF数量与DNA损伤修复蛋白γ-H2AX的表达水平。结果:1.与食管正常黏膜细胞和黏膜组织相比,XRCC3在Kyse150、Kyse510、Kyse410、TE-1、Kyse30五种食管鳞癌细胞以及食管鳞癌组织中,在m RNA水平和蛋白水平都呈高表达。单因素分析发现XRCC3的表达与食管鳞癌患者的放化疗敏感性相关。高表达XRCC3与患者放化疗抵抗有关(P=0.002)。单变量分析显示高表达XRCC3,疾病相关生存较差(P=0.017)。多因素分析发现XRCC3表达水平、放化疗反应以及M分期分别为食管鳞癌患者疾病相关生存的独立预测因子(P=0.011、0.007、0.041)2.在TE-1和Kyse30细胞中,成功建立psh RNA-XRCC3及p CDH-XRCC3的稳定细胞系,在体外实验中psh RNA-XRCC3组可以明显降低XRCC3的表达水平,而p CDH-XRCC3组恢复了XRCC3的表达(P0.05)。3.在体内体外实验中,沉默XRCC3的表达能够增加食管鳞癌TE-1和Kyse30细胞的放疗敏感性。克隆形成实验显示:XRCC3表达水平对细胞克隆形成能力没有影响,但经放疗后,psh RNA-XRCC3组克隆形成能力显著下降(P0.01)。裸鼠移植成瘤实验显示:在放疗后沉默XRCC3组与对照组相比,显著增强放疗对移植瘤生长的抑制效应。4.沉默XRCC3的表达能够促进放疗诱导食管鳞癌TE-1和Kyse30细胞的凋亡与有丝分裂灾难。与Control组和p CDH-XRCC3组(回复表达XRCC3组)相比,psh RNA-XRCC3组和IR组的细胞凋亡和有丝分裂灾难比率增加,且IR+psh RNA-XRCC3组的细胞在照射后48h,凋亡及有丝分裂灾难发生率显著增加(P0.01)。psh RNA-XRCC3组与对照组相比,凋亡相关蛋白Cleaved-PARP和Cleaved-Casbase-3表达水平有显著的升高,而同源重组修复相关蛋白XRCC2和Rad51.3表达水平则有明显降低。5.沉默XRCC3的表达能够增强食管鳞癌TE-1和Kyse30细胞放疗所诱导的DNA损伤及端粒功能紊乱。与Control组和p CDH-XRCC3组相比,psh RNA-XRCC3组的细胞在放射照射后48h,DNA损伤修复蛋白γ-H2AX和端粒功能紊乱诱导形成的TIF都显著增加,说明沉默XRCC3后,放疗显著增加细胞DNA的损伤以及端粒的功能紊乱(P0.01)。结论:XRCC3通过增强放疗诱导的DNA损伤修复和(或)保护端粒的稳定性,来增强食管鳞癌对放疗的抵抗作用。XRCC3可能是食管鳞癌放疗敏感性的预测因子,有望成为食管鳞癌放疗的有效治疗靶点。
【关键词】：食管鳞状细胞癌 XRCC3 放疗 端粒稳定性 凋亡 有丝分裂灾难
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.1
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 缩略语/符号说明12-13
• 前言13-15
• 研究现状、成果13-14
• 研究目的、方法14-15
• 1 对象和方法15-38
• 1.1 实验材料15-18
• 1.1.1 病人及组织标本15-16
• 1.1.2 细胞系16-18
• 1.2 实验所需主要试剂及溶液的配制18-20
• 1.2.1 细胞培养所需18
• 1.2.2 其他实验所需18-20
• 1.3 主要仪器设备20-21
• 1.4 实验方法21-37
• 1.4.1 细胞培养（Cell culture）21-23
• 1.4.2 RT-PCR23-25
• 1.4.3 免疫印迹（Western Blot）25-30
• 1.4.4 免疫组织化学(Immunohistochemistry)30-31
• 1.4.5 稳定细胞系的构建（Construction of stable cell lines）31-33
• 1.4.6 克隆形成实验（Clonogenic survival assay）33-34
• 1.4.7 体内裸鼠荷瘤生长实验（In vivo tumor growth assay）34-35
• 1.4.8 流式细胞仪 Annexin-V/PI 双标记法检测细胞凋亡（Annexin-V-FITC?propidium iodide flow cytometry apoptosis assay）35-36
• 1.4.9 免疫荧光实验（Immunofluoresence staining assay）36-37
• 1.5 统计学分析(Statistical analyses)37-38
• 2 结果38-46
• 2.1 XRCC3在食管鳞癌细胞和食管鳞癌组织中呈高表达38-39
• 2.2 高表达XRCC3与食管鳞癌患者放化疗抵抗及不良预后有关39-41
• 2.3 在体内体外实验中，低表达XRCC3能够增加食管鳞癌TE-1和Kyse30细胞的放疗敏感性41-43
• 2.4 沉默XRCC3的表达能够增强放疗诱导的食管鳞癌TE-1和Kyse30细胞的凋亡和有丝分裂灾难43-45
• 2.5 沉默XRCC3的表达能够增强放疗所诱导食管鳞癌TE-1 和Kyse30细胞的DNA损伤及端粒功能紊乱45-46
• 3 讨论46-48
• 结论48-49
• 参考文献49-53
• 发表论文和参加科研情况说明53-54
• 综述 DNA修复基因XRCC3作用机制及其与肿瘤发生发展的研究进展54-63
• 综述参考文献59-63
• 致谢63-65
• 个人简历65

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本文编号：763527