USP14去泛素化vimentin及miR-320a下调USP14和vimentin来共同调节胃癌细胞的恶性行为

发布时间：2017-08-31 14:43

  本文关键词：USP14去泛素化vimentin及miR-320a下调USP14和vimentin来共同调节胃癌细胞的恶性行为

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【摘要】：目的胃癌(Gastric cancer)是消化道的一种常见恶性癌症,是世界上导致死亡的第三种癌症。尽管近年来胃癌的诊断和治疗得到了进一步的发展,但由于胃癌的转移和再发风险比较高,胃癌的死亡率仍然很高。因此,研究胃癌的发生和转移机制十分重要,并且缺乏有效的生物标志物检测早期胃癌的发生及发展。现代生物医学研究利用血清蛋白抗原,致癌基因或基因家族通过先进的分子生物学技术,如微阵列、RNA-Seq等等,探究了许多潜在的胃癌生物标记基因。近年来,vimentin在上皮间质转化(EMT)和癌症生长转移过程中起的重要作用受到越来越多的关注。本课题主要研究vimentin、USP14和miR-320a在胃癌细胞中的恶性行为,探究它们在胃癌中相互调节的网络结构,为胃癌的早期诊断和转移治疗提出一个新的思路。方法首先应用RT-qPCR检测胃癌组织中vimentin的表达水平,并研究vimentin在胃癌恶性行为中的作用。接着,我们寻找研究vimentin在胃癌组织和正常癌旁组织之间表达差异的影响机制及其对胃癌细胞恶性行为的影响,运用泛素化和免疫共沉淀实验(Co-IP)来探究vimentin表达水平增高的调节机制,发现USP14通过影响vimentin的泛素化进而影响其在胃癌中的表达水平。然后,分别运用MTT、集落形成、迁移和侵袭实验分别检测USP14对胃癌细胞活力、细胞增殖能力、迁移和侵袭能力的作用,证实了USP14对胃癌细胞恶性行为的影响。此外,我们通过生物信息学预测分析发现miR-320a可以同时靶定和下调vimentin和USP14,接着,我们又进一步研究了miR-320a对胃癌恶性行为的影响。最后,运用RT-qPCR检测了USP14及miR-320a在胃癌组织及正常胃组织中差异性表达及相关性分析,阐明了miR-320a可以通过对vimentin和USP14的调节作用来抑制胃癌的恶性行为。结果RT-qPCR检测发现胃癌组织与癌旁正常组织相比vimentin的表达水平显著增高,MTT、集落形成、迁移和侵袭实验表明vimentin促进胃癌细胞的恶性行为。进一步的泛素化实验和免疫共沉淀实验证明了USP14与vimentin具有相互作用,并且USP14通过去泛素化vimentin来增加vimentin在胃癌细胞中表达水平。细胞表型实验证明了USP14也促进胃癌细胞的恶性行为。此外,发现miR-320a与vimentin和USP14的3’UTR具有特异性结合位点,并且发现miR-320a直接靶定和下调USP14和vimentin,并且通过细胞表型实验证明了miR-320a在胃癌组织中具有抑癌作用。最后,RT-qPCR检测发现在胃癌组织中,miR-320a与USP14和vimentin均呈负相关关系。结论胃癌组织中vimentin表达水平增高,并且vimentin可以促进胃癌细胞的恶性行为。进一步我们研究发现USP14可以通过去泛素化vimentin来增加其在胃癌细胞的表达水平。此外,我们发现了miR-320a可以在转录后水平调节vimentin的表达水平,研究证明了miR-320a不仅可以通过结合vimentin的3’UTR直接下调vimentin的表达,还可以通过直接靶定和下调USP14的表达水平来间接减少胃癌细胞中vimentin的表达水平。此外,miR-320a可以通过下调USP14和vimentin来抑制胃癌细胞的恶性行为。综上所述,这些研究结果为胃癌的研究及检测提出了新的思路。
【关键词】：vimentin USP14 miR-320a 胃癌
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 缩略语11-12
• 前言12-15
• 研究现状、成果12-14
• 研究目的、方法14-15
• 一、检测胃癌组织和胃癌细胞中vimentin的表达水平15-31
• 1.1 材料和方法15-26
• 1.1.1 实验材料15-16
• 1.1.2 实验方法16-26
• 1.1.3 统计学方法26
• 1.2 结果26-30
• 1.2.1 Vimentin在胃癌组织中的mRNA表达水平增加26
• 1.2.2 Vimentin mRNA在胃癌细胞中的mRNA表达水平增加26-27
• 1.2.3 Vimentin蛋白在胃癌细胞中蛋白表达水平增加27-28
• 1.2.4 Vimentin增加胃癌细胞的生长活力28
• 1.2.5 Vimentin增加胃癌细胞的增殖能力28-29
• 1.2.6 Vimentin增加胃癌细胞的迁移能力29-30
• 1.2.7 Vimentin增加胃癌细胞的侵袭能力30
• 1.3 小结30-31
• 二、USP14去泛素化vimentin并导致其在胃癌中表达上调31-41
• 2.1 材料和方法31-36
• 2.1.1 实验材料31
• 2.1.2 实验方法31-36
• 2.1.3 统计学方法36
• 2.2 结果36-40
• 2.2.1 胃癌细胞中vimentin的泛素化水平降低36-37
• 2.2.2 CoIP证明USP14与vimentin具有相互作用37
• 2.2.3 USP14对vimentin表达水平的影响37-38
• 2.2.4 USP14减少vimentin的泛素化水平38-39
• 2.2.5 USP14突变后对vimentin表达水平和泛素化水平影响39-40
• 2.3 小结40-41
• 三、USP14对胃癌细胞恶性行为的影响41-46
• 3.1 材料和方法41-42
• 3.1.1 实验材料41
• 3.1.2 实验方法41
• 3.1.3 统计学处理方法41-42
• 3.2 结果42-45
• 3.2.1 USP14促进胃癌细胞的生长活力42
• 3.2.2 USP14增加胃癌细胞的增殖能力42-43
• 3.2.3 USP14增加胃癌细胞的迁移能力43
• 3.2.4 USP14增加胃癌细胞的侵袭能力43-44
• 3.2.5 USP14与vimentin在细胞生长和增殖能力中的功能互补实验44
• 3.2.6 USP14与vimentin在细胞迁移和侵袭能力中的功能互补实验44-45
• 3.3 小结45-46
• 四、miR-320a下调vimentin和USP1446-56
• 4.1 材料和方法46-50
• 4.1.1 实验材料46
• 4.1.2 实验方法46-50
• 4.1.3 统计学处理方法50
• 4.2 结果50-55
• 4.2.1 荧光报告载体实验证明mi R-320a直接靶定vimentin50-51
• 4.2.2 荧光报告载体实验证明mi R-320a直接靶定USP1451-52
• 4.2.3 RT-qPCR和Western blot证明miR-320a对vimentin靶定作用52
• 4.2.4 RT-qPCR和Western blot证明miR-320a对USP14靶定作用52-53
• 4.2.5 miR-320a抑制胃癌细胞的生长活力53-54
• 4.2.6 miR-320a抑制胃癌细胞的增殖能力54
• 4.2.7 miR-320a抑制胃癌细胞的迁移能力54-55
• 4.2.8 miR-320a抑制胃癌细胞的侵袭能力55
• 4.3 小结55-56
• 五、miR-320a下调vimentin和USP14来抑制胃癌细胞恶性行为56-64
• 5.1 材料和方法56-57
• 5.1.1 实验材料56
• 5.1.2 实验方法56
• 5.1.3 统计学处理方法56-57
• 5.2 结果57-63
• 5.2.1 USP14在胃癌组织中的表达水平增加57
• 5.2.2 USP14与vimentin在胃癌组织中的表达水平呈正相关关系57-58
• 5.2.3 miR-320a在胃癌组织中的表达水平降低58
• 5.2.4 miR-320a与vimentin和USP14的相关性分析58-59
• 5.2.5 miR-320a可以减弱vimentin促进胃癌细胞活力的作用59
• 5.2.6 miR-320a可以减弱vimentin促进胃癌细胞增殖能力的作用59-60
• 5.2.7 miR-320a可以减弱vimentin对胃癌细胞迁移能力的促进作用60
• 5.2.8 miR-320a可以减弱vimentin对胃癌细胞侵袭能力的促进作用60-61
• 5.2.9 miR-320a可以减弱USP14对胃癌细胞恶性行为的促进作用61
• 5.2.10 miR-320a可以减弱USP14促进胃癌细胞增殖能力的作用61-62
• 5.2.11 miR-320a可以减弱USP14对胃癌细胞迁移能力的促进作用62-63
• 5.2.12 miR-320a可以减弱USP14对胃癌细胞侵袭能力的促进作用63
• 5.3 小结63-64
• 讨论64-68
• 结论68-69
• 参考文献69-74
• 发表论文和参加科研情况说明74-75
• 综述 Vimentin对肿瘤的重要作用及其调控机制75-92
• 综述参考文献86-92
• 致谢92-93
• 个人简历93

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本文编号：766196