miR-128在丝裂霉素C诱导DNA损伤应答中的作用机制研究

发布时间：2017-09-01 12:03

  本文关键词：miR-128在丝裂霉素C诱导DNA损伤应答中的作用机制研究

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【摘要】：DNA损伤应答维持基因组稳定性发挥着重要作用,能够抵挡或者修复内源和外界环境导致的DNA损伤。造成DNA损伤的内源因素如活性氧等,外源因素如紫外射线、离子辐射和化疗药物等。化疗药物发挥抗肿瘤作用的途径之一是对肿瘤细胞内基因组DNA造成损伤,这些DNA损伤类型包括DNA链交联、DNA单／双链断裂和DNA修饰等。丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)在临床上作为化疗药物,引起肿瘤细胞内DNA损伤,但是MMC引起DNA损伤和损伤修复的详细机制仍不明确。在本研究中,MMC刺激肺癌细胞后,细胞活力和克隆形成能力随着刺激浓度增加和刺激时间延长而逐渐减弱；另一个有趣的发现是MMC处理细胞后,miR-128表达水平出现了上调,αⅡ Sp(spectrin)的蛋白水平出现下调,而该基因(SPTAN1)的mRNA水平稳定不变,这些结果提示miR-128可能通过抑制该基因的mRNA翻译,降低其蛋白水平,从而参与MMC引起的DNA损伤应答过程。多种生物学信息软件预测表明SPTAN1是miR-128潜在的靶基因；与此理论预测一致,荧光素报告实验验证miR-128能够直接靶向sTAN1的3'-UTR；过表达或下调miR-128能相应地引起αⅡ Sp蛋白的下调或上调,同时影响αⅡ Sp相关的细胞周期阻滞和染色体结构异常等。最后,免疫共沉淀和荧光共定位实验显不αⅡ Sp可以和FANCA/XPF等DNA修复蛋白共定位,并且相互作用形成复合物。更重要的现象是,miR-128能够影响αⅡ Sp/FANCA/XPF复合物的形成,从而阻碍DNA损伤修复。综上所述,αⅡ Sp作为血影蛋白家族成员之一在DNA损伤修复中起着重要的作用,这种作用通过与FANCA/XPF形成复合物实现,并且这种DNA损伤修复复合物的形成和αⅡ Sp的蛋白水平受到microRNA(miRNA)的精细调节。本文扩大了我们对于MMC抗肿瘤作用机制和miRNA在DNA损伤修复过程中作用机制的了解。miRNA的这种调控机制可以潜在用于肿瘤的辅助治疗,提高提高肿瘤化疗效果,但是后期动物水平和临床应用仍需要进一步的深入探索。
【关键词】：DNA损伤应答 microRNA 丝裂霉素C αⅡ血影蛋白
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R73-36
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 第一章 研究背景综述9-26
• 1.1 DNA损伤应答9-19
• 1.1.1 DNA损伤的类型9-10
• 1.1.2 DNA损伤修复的类型10-17
• 1.1.2.1 直接修复10
• 1.1.2.2 碱基切除修复10-11
• 1.1.2.3 核苷酸切除修复11-13
• 1.1.2.4 错配修复13-14
• 1.1.2.5 同源重组修复14
• 1.1.2.6 非同源末端连接14-15
• 1.1.2.7 DNA交联损伤修复15-17
• 1.1.3 丝裂霉素C17-19
• 1.1.3.1 丝裂霉素C的概述18
• 1.1.3.2 MMC抗肿瘤作用机制18-19
• 1.2 血影蛋白19-22
• 1.2.1 血影蛋白简介19-20
• 1.2.2 血影蛋白功能和DDR的关系20-22
• 1.3 microRNA 和 DDR22-26
• 1.3.1 microRNA概述22-24
• 1.3.2 miRNA在DDR中的作用24-26
• 第二章 实验材料与方法26-39
• 2.1 实验材料26-28
• 2.1.1 细胞株26
• 2.1.2 主要试剂26-27
• 2.1.3 实验中所使用的主要仪器27-28
• 2.1.4 实验中涉及的引物28
• 2.2 实验方法28-38
• 2.2.1 细胞培养28
• 2.2.2 细胞转染实验及丝裂霉素C刺激实验28-29
• 2.2.3 细胞RNA的提取29-30
• 2.2.4 细胞蛋白提取及免疫印记30
• 2.2.5 荧光实时定量PCR30-33
• 2.2.5.1 miRNA表达水平检测30-31
• 2.2.5.2 mRNA表达水平检测31-33
• 2.2.6 生物信息学预测并筛选靶位点33
• 2.2.7 miR-128靶点生物信息学分析33
• 2.2.8 PI法检测细胞周期33
• 2.2.9 细胞中期染色分析实验33-34
• 2.2.10 免疫荧光共定位34
• 2.2.11 Annexin V/PI法检测细胞凋亡34-35
• 2.2.12 荧光素酶活性检测35-36
• 2.2.13 EdU细胞增殖实验36-37
• 2.2.14 细胞克隆形成实验37-38
• 2.3 实验数据的统计分析38-39
• 第三章 实验结果39-63
• 3.1 不同浓度MMC刺激对细胞活力的影响39-40
• 3.2 MMC刺激细胞导致染色体结构异常和DNA损伤40-41
• 3.3 MMC对αⅡ Sp mRNA和蛋白水平的影响41-42
• 3.4 MMC刺激后miR-128表达水平上调42-43
• 3.5 生物信息软件预测miR-128靶向SPTAN1的3’UTR43
• 3.6 荧光素酶报告实验验证miR-128靶向SPTAN1的3’-UTR43-44
• 3.7 过表达或下调miR-128影响αⅡ Sp的表达水平44-46
• 3.8 miR-128抑制细胞分裂增殖能力46-47
• 3.9 miR-128对细胞细胞周期的影响47-48
• 3.10 miR-128对细胞凋亡的影响48-49
• 3.11 miR-128导致细胞染色体异常49-50
• 3.12 miR-128破坏αⅡ Sp/FANCA/XPF形成的复合物50-52
• 3.13 miR-128靶点生物信息学分析52-63
• 讨论与展望63-65
• 附录65-68
• 参考文献68-72
• 攻读硕士学位期间发表成果72-73
• 致谢73-74

【参考文献】

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1 ZHANG Rui;ZHANG ChenYu;ZHAO Qi;LI DongHai;;Spectrin:Structure, function and disease[J];Science China(Life Sciences);2013年12期

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本文编号：771958