Tf-PEG-PEI载RNA干扰质粒靶向沉默PC-3细胞核干因子的体外实验研究

发布时间：2017-09-01 13:24

  本文关键词：Tf-PEG-PEI载RNA干扰质粒靶向沉默PC-3细胞核干因子的体外实验研究

  更多相关文章： 前列腺癌 核干因子 RNA干扰 基因治疗 聚乙烯亚胺 非病毒载体 聚乙二醇

【摘要】：目的:合成多功能阳离子聚合物Tf-PEG-PEI,建立一个生物相容性高、靶向、高效的RNAi传递系统,使RNA干扰沉默前列腺癌PC-3细胞核干因子。方法:首先鉴定和提取核干因子的RNA干扰质粒(NS-shRNA),同时合成载体Tf-PEG-PEI及鉴定其结构的正确。将质粒NS-shRNA分别与阳离子聚合物PEI和Tf-PEG-PEI与形成复合物,研究两种复合物在电解质、血清及核酸酶存在的情况下,PEG化后的复合物结合比、粒径及zeta电位大小,载体是否能保护DNA免受核酸酶的降解,以及载体Tf-PEG-PEI是否对前列腺癌PC-3细胞具有靶向性。其后培养前列腺癌细胞系PC-3,通过MTT实验检验载体Tf-PEG-PEI对PC-3细胞的毒性,通过荧光倒置显微镜及流式细胞仪测定转染效率,同时以Tf-PEG-PEI为载体介导核干因子干扰质粒NS-shRNA转染PC-3细胞,提取细胞总RNA及蛋白,RT-PCR及Western blot检测核干因子(NS)基因沉默效果。结果:通过质粒扩增和测序鉴定,NS的RNA干扰序列成功插入载体GV248上,测序图谱与预期一致。通过载体洗脱峰与蛋白凝胶电泳,证明成功合成了非病毒载体Tf-PEG-PEI。经过PEG水化修饰后,Tf-PEG-PEI/NS-shRNA复合物在电解质、蛋白质的存在下,粒径缩小,zeta电位为10mV,保持弱阳性,有利于提高转染效率。Tf-PEG-PEI/NS-shRNA复合物在N/P比为7.5时可以完全复合;当Tf-PEG-PEI:NS-shRNA的N/P比为20时,在荧光显微镜和流式细胞仪测定结果显示转染效率最大;MTT结果显示,当Tf-PEG-PEI的浓度应为40μg/mL,NIH3T3细胞存活率在80%以上。通过Realtime-PCR和Westemblot检测,NS的mRNA和蛋白表达在经过Tf-PEG-PEI/NS-shRNA转染后,与未转染组及空载体组比较,NS的mRNA和蛋白表达明显下调,具有统计学意义(P0.05)。结论:多功能载体Tf-PEG-PEI与NS-shRNA复合后,可以保护DNA免内源性核酸酶的降解,PEG的水化层可避免聚合物之间聚集,减少了与血浆蛋白聚集,但PEG链段的接入还是会在一定程度上影响材料内化入细胞后的逃逸和转运能力。通过前列腺癌PC-3细胞表面的转铁蛋白受体可以实现对肿瘤的靶向效应。多功能载体Tf-PEG-PEI可以介导NS-shRNA有效地沉默前列腺癌PC-3中NS基因的表达,Tf-PEG-PEI是一种生物相容性好、靶向、高效的基因递送系统。NS在临床的治疗上具有潜在的意义。在基因治疗的方案中,使用的RNAi技术是一个有极大希望的治疗策略。
【关键词】：前列腺癌 核干因子 RNA干扰 基因治疗 聚乙烯亚胺 非病毒载体 聚乙二醇
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.25
【目录】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-8
• 缩略语/符号说明8-10
• 前言10-13
• 研究现状、成果10-12
• 研究目的、方法12-13
• 实验对象和方法13-31
• 1 实验对象13-19
• 2 实验方法19-31
• 结果31-42
• 讨论42-46
• 结论46-47
• 参考文献47-51
• 发表论文和参加科研情况说明51-52
• 综述 前列腺癌的基因治疗52-58
• 综述参考文献56-58
• 致谢58

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本文编号：772330