用于单细胞分析的微流控芯片研究及其在肿瘤干细胞分离鉴定方面的应用

发布时间：2017-09-01 16:22

  本文关键词：用于单细胞分析的微流控芯片研究及其在肿瘤干细胞分离鉴定方面的应用

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【摘要】：细胞是生命活动的基本单位,传统的细胞学研究依赖于大量细胞(103-104个),把群体值作为测量结果。然而研究发现,即使是生活在同一环境、同一组织中的同种细胞,其在基因表达水平上也存在着很大差异。细胞之间存在异质性,而群体分析会掩盖细胞个体间的差异,因此,开发一种能有效分析单细胞组分的技术势在必行。微流控芯片技术可以实现细胞进样、单细胞捕获、细胞培养、细胞分选、细胞裂解以及分析检测多个步骤整合在一起,并且具有高通量、小型化、平行化、自动化、便携化等优势,为单细胞研究提供了一个可行的技术平台。本论文研制了具有自主知识产权的单细胞分析微流控芯片,微流控芯片的主体采用了聚二甲基硅氧烷(poly(dimethylsiloxane), PDMS)高聚物材料,利用PDMS高聚物具有良好气体溶解性的特点实现负压自吸式自动进样,使所研制的芯片像临床的真空采血管一样方便使用,不需辅助设备控制流路。将数千个细胞单独分隔到不同的微反应室,不再互相干扰,也不易发生漏检,实现高通量单细胞快速分离；随即将分离开的单细胞直接进行反转录PCR(RT-PCR),节省了时间。每个反应室容积5-10 nL,上千反应室的一块芯片也仅需试剂数微升,节省试剂。本研究取得了以下创新性结果：(1)成功研制了集单细胞捕获、裂解、RT-PCR反应于一体的微流控芯片,并能用于单细胞数字PCR研究,通过研究不同单个A549肿瘤干细胞中CD133和管家基因GAPDH的基因表达验证了细胞之间存在异质性。(2)基于所研制的单细胞微流控芯片实现了一步法快速鉴定肿瘤干细胞,利用肿瘤干细胞表面标志物CD133对肺癌A549细胞中肿瘤干细胞进行鉴定。本文中所研制的微流控芯片易于操作、敏感度高(单细胞)、准确性好(可计数)、省试剂(数微升/芯片),适合于普通实验室进行肿瘤干细胞等稀少细胞的快速鉴定。为肿瘤干细胞的研究提供了一种单细胞分离与特异性鉴定的新工具,可用于鉴定肿瘤干细胞的分子遗传特征和特异标志物,解决肿瘤千细胞特异性鉴定困难的问题。为肿瘤学研究提供科学依据,为临床病情判断、病程监控和预测,指导治疗等奠定基础。
【关键词】：微流控芯片 单细胞 数字PCR 肿瘤干细胞 分离鉴定
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R73-3;Q813
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 第1章 绪论12-40
• 1.1 课题背景12-13
• 1.2 微流控芯片操纵单元13-25
• 1.2.1 单细胞捕获13-17
• 1.2.1.1 重力离心13-15
• 1.2.1.2 流体动力学15-16
• 1.2.1.3 介电电泳16-17
• 1.2.2 细胞分选17-21
• 1.2.2.1 荧光激发分选18-19
• 1.2.2.2 磁力分选19-20
• 1.2.2.3 层流分选20-21
• 1.2.3 细胞裂解21-25
• 1.2.3.1 化学裂解21-22
• 1.2.3.2 机械裂解22-23
• 1.2.3.3 激光裂解23-24
• 1.2.3.4 热裂解24
• 1.2.3.5 电裂解24-25
• 1.3 微流控技术在单细胞研究方面的应用25-33
• 1.3.1 细胞培养25-26
• 1.3.2 单细胞基因表达分析26-28
• 1.3.2.1 RT-qPCR26-27
• 1.3.2.2 高通量微流控单细胞数字PCR27-28
• 1.3.3 单细胞基因组测序28-31
• 1.3.4 单细胞蛋白质分析31-33
• 1.4 单细胞微流控系统商品化现状33-34
• 1.4.1 C1单细胞自动制备系统33
• 1.4.2 DEPArray系统33-34
• 1.5 本文研究内容34-36
• 1.6 参考文献36-40
• 第2章 单细胞微流控芯片的研制及其在单细胞数字PCR方面的应用40-64
• 2.1 引言40-42
• 2.2 实验部分42-52
• 2.2.1 实验仪器与装置42
• 2.2.2 实验材料与试剂42-43
• 2.2.3 实验操作43-52
• 2.2.3.1 单细胞微流控掩膜的设计43-45
• 2.2.3.2 模具制作45-47
• 2.2.3.3 芯片制作47
• 2.2.3.4 细胞培养47-48
• 2.2.3.5 肿瘤干细胞培养及单细胞悬液制备48-49
• 2.2.3.6 细胞裂解49-50
• 2.2.3.7 实时荧光定量PCR检测50
• 2.2.3.8 单细胞数字PCR检测50-52
• 2.2.3.9 检测与分析52
• 2.3 结果与分析52-59
• 2.3.1 单细胞微流控芯片的设计52-53
• 2.3.2 单细胞微流控芯片的进样53-55
• 2.3.3 单细胞数字PCR55-59
• 2.4 结论与展望59-61
• 2.5 参考文献61-64
• 第3章 单细胞微流控芯片通过一步法RT-PCR分选与鉴定A549肿瘤干细胞64-82
• 3.1 引言64-65
• 3.2 实验部分65-70
• 3.2.1 仪器装置65-66
• 3.2.2 试剂与仪器66-67
• 3.2.3 实验操作67-70
• 3.2.3.1 单细胞微流控芯片的设计与制作67
• 3.2.3.2 单细胞悬液的制备67-69
• 3.2.3.3 单细胞微流控芯片的进样与操作69-70
• 3.2.3.4 检测与分析70
• 3.3 结果与分析70-77
• 3.3.1 单细胞微流控芯片的设计70-71
• 3.3.2 肿瘤干细胞的培养及单细胞微流控芯片的进样71-75
• 3.3.2.1 肿瘤干细胞培养71-72
• 3.3.2.2 肿瘤干细胞染色72-74
• 3.3.2.3 肿瘤干细胞大小及单细胞微流控芯片的进样74-75
• 3.3.3 单细胞微流控芯片的单细胞捕获75
• 3.3.4 单细胞RT-PCR反应结果75-77
• 3.4 结论与展望77-79
• 3.5 参考文献79-82
• 攻读硕士学位期间主要的研究成果82-84
• 致谢84

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