高保真DNA聚合酶分子开关在EGFR基因突变检测中的应用

发布时间：2017-09-01 17:13

  本文关键词：高保真DNA聚合酶分子开关在EGFR基因突变检测中的应用

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【摘要】：目的:针对五种可指导非小细胞肺癌临床个体化用药的相关EGFR突变基因,建立由高保真DNA聚合酶介导的突变敏感性分子开关技术平台,并结合多重PCR,荧光定量PCR等诊断技术,研发出一种快速,灵敏,廉价的EGFR基因诊断方法,以指肺癌的个体化治疗。方法:相关统计数据表明,酪氨酸激酶抑制剂(TKI)(如吉非替尼,厄酪替尼)等肺癌治疗药物的疗效在很大程度上由酪氨酸激酶的编码区基因突变与否决定。其中,最为重要的突变包括第19外显子15个碱基缺失,18个碱基缺失,L858R突变,S768I突变,以及获得性突变T790M。本研究将含有EGFR突变的基因和野生基因,运用PCR等技术,亚克隆于质粒载体中,经转化铺板以及质粒提取和扩增等一系列的步骤来获得含有EGFR载体,之后再根据构建好的载体来制备突变和野生的EGFR模板。根据EGFR相关序列,针对S768I,T790M,L858R,15-bp和18-bp缺失5个突变位点,设计相应的分子开关引物(通过硫化磷酸化修饰,使之与突变模板完全吻合;而不完全与野生模板相吻合,具有针对突变的特异性)来构成检测EGFR突变的特异性体系。并且将该体系结合多重PCR,荧光定量PCR等相关技术,检测肺癌患者的肿瘤样本,也可进一步对血液中游离DNA进行尝试检测。结果:本课题成功研发出针对五种EGFR突变基因的分子开关突变检测系统。该突变检测系统具有较高的灵敏性何特异性。对于与硫化修饰引物完全配对的突变模板其检测的灵敏性达到10到100个拷贝,而对于与硫化修饰引物不完全配对的野生在模板浓度高于106个拷贝时候才出现扩增,因此其特异性可达到106至107。当荧光定量PCR以及多重PCR利用此体系来检测,它们得到的结果与普通PCR较为一致。在仅有万分之一突变模板浓度(突变模板:野生模板=1:10000)下,该体系仍能检测到突变的存在。最为重要的是,运用该体系检测20例肺癌样本,成功检测出L858R突变患者两例,经测序验证结果正确,表明该检测平台完全可以应用到临床诊断。结论:高保真酶介导的突变敏感性分子开关技术,对EGFR基因突变的检测有较高的特异性和灵敏度,其高灵敏性的优点对微量突变的检测有重大的临床意义,优于传统测序技术,是指导临床个体化用药,产前诊断以及肿瘤早期发现的有力的分子诊断工具。
【关键词】：高保真酶分子开关 基因诊断 肺癌 EGFR基因
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 引言9-11
• 研究材料11-13
• 研究方法13-26
• 研究结果26-35
• 讨论35-38
• 结论38-39
• 参考文献39-42
• 综述 非小细胞肺癌的靶向治疗与EGFR基因突变的研究进展42-55
• 参考文献47-55
• 攻读学位期间发表的论文、科研成果55-56
• 附录56-59
• 致谢59-60

【参考文献】

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1 彭翠英,廖端芳,张佳,陈琳玲,李凯;单核苷酸多态性及其检测方法[J];中华检验医学杂志;2004年10期

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本文编号：773355