miR-1000在对虾抗病毒免疫中的作用及miR-71促进胃癌细胞自噬的机制

发布时间：2017-09-01 17:24

  本文关键词：miR-1000在对虾抗病毒免疫中的作用及miR-71促进胃癌细胞自噬的机制

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【摘要】：MicroRNA (miRNA)是一类长度为22nt左右的内源非编码小RNA,进化上比较保守,广泛存在于动物、植物还有病毒等多种生物中。miRNA通过种子序列(第2-8个碱基)与靶基因mRNA的3’非翻译区(untranslational region, UTR)配对结合,进而实现其对基因表达的转录后调控。本论文对miRNA在病毒感染中的作用及miRNA调控自噬的机制进行了研究。研究发现,miRNA在病毒与宿主互作的过程中起关键作用。白斑综合症病毒(White Spot Syndromic Virus, WSSV)是一种致病力极强的双链DNA病毒,可以感染大部分虾蟹,感染后会出现白色斑点,死亡率极高,带来巨大经济损失。本实验室前期研究表明,WSSV感染对虾后,对虾的miRNA表达谱发生了明显改变,对虾编码的miR-1000可能参与对虾抗病毒免疫。因此,本论文进一步探索对虾miR-1000的抗病毒机理。研究发现,WSSV感染对虾后,对虾miR-1000表达显著上调,说明其与对虾抗病毒有关。在High Five昆虫细胞中进行试验,结果显示对虾miR-1000与其靶基因即病毒早期基因wsv191和wsv407直接互作。对虾体内试验表明,对虾血淋巴细胞中miR-1000过表达后,2个靶基因表达量明显下调：当敲低miR-1000表达时,wsv191和wsv407表达量显著上调。昆虫细胞试验和对虾体内试验表明,miR-1000可调控靶基因wsv191和wsv407的表达。在对虾体内,miR-1000过表达后,WSSV拷贝数和病毒感染对虾的死亡率与对照组相比都明显下降。利用反义核酸敲低miR-1000表达后,WSSV拷贝数和对虾死亡率与对照组相比显著上升。研究发现,病毒早期基因wsv191和wsv407在WSSV复制过程中起重要作用,wsv191和wsv407的下调表达会降低WSSV拷贝数和对虾死亡率。这些结果说明,对虾编码的miR-1000在病毒感染中可通过作用于病毒早期基因wsv191和wsv407来发挥抗病毒作用。为了探究宿主miR-1000是否同时调控这两个靶基因的表达,分别从miR-1000介导靶基因mRNA降解的体外试验和miR-1000与靶基因mRNA细胞内共定位两方面研究。利用凝胶迁移阻滞技术,研究发现miR-1000在Ago复合体中能同时作用于wsv191和wsv407。利用荧光原位杂交技术,发现miR-1000和靶基因wsv191以及wsv407在对虾血淋巴细胞中共定位。因此,本研究揭示了动物miRNA可同时调控两个靶基因表达。自噬在真核生物中广泛存在,将细胞内变性、损伤或衰老的蛋白质和细胞器运输到溶酶体中进行降解,为细胞正常生命活动提供能量。正常细胞中自噬活性通常比较低,而肿瘤发生发展的阶段以及肿瘤的类型都会影响自噬的活性。一方面,自噬能有效防止代谢废物对细胞及基因组的损伤,发挥抑癌作用。另一方面,自噬可为肿瘤细胞提供各种能量物质,有助于肿瘤细胞在低氧和低营养的情况下存活。研究表明,肿瘤细胞中miRNA可以调控许多自噬相关基因,miRNA的表达或缺失都会引起自噬水平的改变,从而影响肿瘤细胞的生长。本实验室已有研究发现,对虾miR-71通过抑制亲环素基因表达,诱导细胞自噬,在病毒感染中促进病毒复制。由于miR-71在不同物种中十分保守,我们猜测在胃癌细胞中miR-71可能调控细胞自噬,因此对这一问题进行了研究。研究发现,不同胃癌细胞中miR-71表达量都要比胃永生化细胞GES中的表达量高,miR-71过表达能增强胃癌细胞自噬水平,miR-71敲低则减弱自噬水平,说明miR-71能够影响胃癌细胞自噬水平的变化。miR-71可以靶向3条与自噬有关的靶基因即G3BP1、MTMR4和PAK2,在High Five昆虫细胞中,miR-71可与这3条靶基因直接互作；胃癌细胞中的试验表明,miR-71过表达使靶基因表达量下调,敲低miR-71表达则使靶基因表达量上调。研究还发现,G3BP1、MTMR4和PAK2在胃癌细胞中能够抑制细胞自噬。这些结果说明,miR-71可通过作用于G3BP1、MTMR4和PAK2来影响胃癌细胞自噬活性。为了探究miR-71是否同时调控3个靶基因的表达,一方面利用凝胶迁移阻滞技术研究miR-71介导靶基因mRNA的降解,另一方面进行miR-71与靶基因mRNA细胞内共定位分析。结果发现,miR-71在Ago复合体中可同时作用于3个靶基因,miR-71和靶基因G3BP1、MTMR4以及PAK2在胃癌细胞中共定位。因此,本研究揭示了miR-71通过同时作用于3个与自噬有关的靶基因(G3BP1、MTMR4和PAK2)促进胃癌细胞自噬。
【关键词】：miR-1000 病毒感染 miR-71 自噬
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S945.4;R735.2
【目录】：

• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 1 引言13-25
• 1.1 microRNA作用的机制13-16
• 1.1.1 microRNA的产生过程13-14
• 1.1.2 microRNA作用于靶基因的机制14-15
• 1.1.3 microRNA的功能15-16
• 1.2 microRNA在病毒感染中的作用16-19
• 1.2.1 宿主编码的microRNA16-17
• 1.2.2 病毒编码的microRNA17-19
• 1.3 microRNA对自噬的调控作用19-23
• 1.3.1 自噬关键基因20-22
• 1.3.2 参与自噬调控的microRNA22
• 1.3.3 自噬与肿瘤的关系22-23
• 1.4 本论文研究的目的与意义23-25
• 2 材料与方法25-47
• 2.1 材料25-31
• 2.1.1 实验用动物、细胞、菌株及质粒25
• 2.1.2 主要试剂25-26
• 2.1.3 主要仪器设备26-28
• 2.1.4 常用溶液和培养基28-31
• 2.2 方法31-47
• 3 结果与分析47-79
• 3.1 miR-1000在对虾抗病毒免疫中的作用47-63
• 3.1.1 miR-1000与病毒感染的关系47-50
• 3.1.2 miR-1000抗病毒的机制50-55
• 3.1.3 靶基因wsv191和wsv407在病毒感染中的作用55-57
• 3.1.4 miR-1000同时调控两个靶基因表达57-63
• 3.1.5 对虾编码的miR-1000在病毒感染中的作用模式63
• 3.2 miR-71促进胃癌细胞自噬的机制63-79
• 3.2.1 miR-71与自噬调控的关系63-66
• 3.2.2 miR-71作用机制66-73
• 3.2.3 miR-71靶基因与自噬的关系73-76
• 3.2.4 miR-71同时调控3个靶基因表达76-79
• 4 讨论79-82
• 5 小结与展望82-84
• 参考文献84-95
• 作者简历95-96
• 致谢96

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