缝隙连接蛋白Cx26在肝细胞癌中的表达及其对奥沙利铂抗肿瘤作用的影响研究

发布时间：2017-09-02 21:23

  本文关键词：缝隙连接蛋白Cx26在肝细胞癌中的表达及其对奥沙利铂抗肿瘤作用的影响研究

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【摘要】：目的:检测肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC,简称“肝癌”)癌变过程中缝隙连接蛋白26(Connexin26,Cx26)及其组成的细胞缝隙连接(Gap Junction,GJ)功能的改变;在明确其表达基础上,进一步探讨调控HCC细胞中Cx26及其组成GJ的功能对奥沙利铂(oxalipatin,OXA)抗肿瘤作用的影响。以期为探讨HCC低化疗反应性的机制提供新的资料和理论基础。方法:采用免疫组化法检测20例正常肝组织及76例HCC组织中Cx26的表达及定位,在明确Cx26有异常表达的基础上,进一步在人正常肝细胞(LO2)及肝癌细胞(SMMC-7721)上,采用RT-PCR和Western blot法检测Cx26的表达,免疫荧光法观察Cx26的定位,细胞接种荧光示踪法(Parachute assay)测定GJ功能。明确GJ功能改变基础上,进一步在SMMC-7721细胞上,通过高低密度接种细胞、GJ工具药和特异性调控Cx26表达等方法调控GJ功能,采用MTT法观察GJ功能改变对OXA抗肿瘤作用的影响。结果:1.HCC癌变过程中Cx26及其组成GJ功能的改变1.1人正常肝组织及HCC组织中Cx26的表达免疫组化法检测结果显示:正常肝组织Cx26蛋白均表达阳性,而HCC组Cx26蛋白表达阳性率显著下调至47.37%(χ2=18.045,P=0.000)。且在正常肝组织中,阳性表达的Cx26呈线状分布于细胞膜上,偶见细胞质表达;而在HCC组织中,阳性染色颗粒主要分布于细胞质内,偶见同时有部分细胞膜着色。蛋白自细胞膜向细胞质定位改变称为“内化”(internalization)现象。Cx26内化率在正常肝脏组织及HCC组分别为15%和100%,两组比较有统计学差异(χ2=43.938,P=0.000)。1.2人正常肝细胞(LO2)及HCC细胞(SMMC-7721)Cx26的表达及GJ功能状态RT-PCR联合western blotting检测结果显示:人正常肝细胞LO2中Cx26表达水平相对较高,而肝癌细胞SMMC-7721中Cx26表达水平较低。免疫荧光实验表明LO2细胞上Cx26的膜定位明显,而在SMMC-7721细胞上,Cx26弥散分布于细胞质中,仅有少量呈细颗粒状定位于细胞膜。进一步使用Parachute assay检测GJ功能时发现:LO2细胞GJ功能丰富,而SMMC-7721细胞GJ功能较弱。2.调控HCC细胞(SMMC-7721)上GJ功能对OXA抗肿瘤作用的影响2.1 OXA对SMMC-7721抗肿瘤作用的影响MTT法检测OXA(0、1、2、4、8、16、32、64、128μg/ml)作用24 h、48 h、72 h后SMMC-7721细胞的存活率,结果显示,随着OXA作用浓度和时间的增加,SMMC-7721细胞存活率逐渐降低。其中32、64、128μg/ml三个剂量组抑制作用明显,该剂量级用于后续实验。2.2 GJ形成对OXA抗肿瘤作用的影响通过高低密度接种细胞法,分别获得有GJ形成细胞和无GJ形成细胞,结果发现OXA的抗肿瘤作用在有GJ形成细胞显著高于无GJ形成细胞(P0.05)。2.3工具药调控GJ功能对OXA抗肿瘤作用的影响2.3.1工具药对SMMC-7721细胞GJ功能的影响Parachute assay实验结果显示,10μM全反式维甲酸(All-transretinoic acid,ATRA)处理SMMC-7721细胞24 h,细胞荧光传递功能显著增强,即细胞间GJ功能显著增强,增强率约为72%;5μM 18-α-甘草次酸(18-α-glycyrrhetinic acid,18-α-GA)作用SMMC-7721细胞1 h,细胞荧光传递功能显著降低,即细胞间GJ功能显著降低,抑制率约为63%。2.3.2工具药调控GJ功能后对OXA抗肿瘤作用的影响MTT结果表明,10μM ATRA单药作用24 h对SMMC-7721细胞生长无明显影响,但使用其预处理细胞24 h以增强GJ功能后,再使用64μg/ml OXA作用细胞24 h,细胞存活率较单用OXA组显著降低(P0.05);5μM 18-α-GA单药作用1 h对SMMC-7721细胞生长也无明显影响,但使用其预处理细胞1 h以抑制GJ功能后,再使用64μg/ml OXA作用SMMC-7721细胞24 h,SMMC-7721细胞存活率较单用OXA组显著增加(P0.05)。2.4特异性调控Cx26表达对OXA抗肿瘤作用的影响以小干扰RNA(Small interfering RNA,si RNA)技术瞬时沉默SMMC-7721细胞中Cx26蛋白的表达,采用MTT法检测SMMC-7721细胞中Cx26蛋白被下调后对OXA抗肿瘤作用的影响,实验结果表明,抑制Cx26蛋白表达后,SMMC-7721细胞存活率明显增加(P0.05)。相反,以瞬时转染法将Cx26-DNA导入SMMC-7721细胞过表达Cx26蛋白,SMMC-7721细胞存活率显著降低(P0.05)。结论:1.HCC癌变过程中伴随有Cx26蛋白表达下调及定位异常,两者共同致组成的GJ功能显著下调。2.在HCC细胞(SMMC-7721)上,增强GJ功能可以增强OXA抗肿瘤作用,而抑制GJ功能可以降低OXA抗肿瘤作用。
【关键词】：缝隙连接蛋白26 细胞缝隙连接 肝细胞癌 奥沙利铂 抗肿瘤作用
【学位授予单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-18
• 材料与方法18-31
• 实验结果31-39
• 讨论39-44
• 结论44-45
• 参考文献45-49
• 致谢49-50
• 附录A:英中文术语缩略语对照表50-51
• 附录B:常用试剂配制方法51-52
• 附录C:个人简历及发表的论文52-53
• 附录D:综述 缝隙连接细胞间通讯与肝细胞癌关系的研究进展53-61
• 参考文献59-61

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本文编号：780980