非小细胞肺癌患者尿蛋白质组的差异表达分析

发布时间：2017-09-04 04:26

  本文关键词：非小细胞肺癌患者尿蛋白质组的差异表达分析

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【摘要】：目的:肺癌在发达国家已成为癌症死亡的主要原因[1],而其中非小细胞肺癌(non small cell lung cancer NSCLC)约占肺癌总数的80%。尽管不断改善肺癌的各种诊断和治疗方法,但60%非小细胞肺癌患者在接受治疗时已处于晚期[2]。其5年生存率不超过10%,然而Ⅰ期非小细胞肺癌的5年生存率却高达70%[3]。故早期诊断是非小细胞肺癌治疗成功的一个关键因素,只有通过早期诊断后选择优化的治疗方案,才能增加NSCLC患者的治愈成功率。因此,寻找早期非小细胞肺癌临床筛查方法和手段尤为重要。尿液是除血浆之外另一种寻找潜在疾病生物标志物的重要生物材料。虽然尿液蛋白质的表现主要反映在泌尿生殖系统疾病,多数研究也局限于肾脏和泌尿道病变。但最近数据表明,尿液蛋白质组学分析也可高度信息化的表达在其他非泌尿系统疾病中,并将有可能应用于这些疾病的临床。又因临床上能够简便、无创伤的获得大量尿液标本,因此尿液蛋白质组学研究日益受到重视[4]。鉴于尿液蛋白质组成成分和功能研究可能对某些疾病,特别是肿瘤性疾病的发生、诊断、预防和治疗有很大意义,所以本研究分析比较了健康人、肺部良性病变与非小细胞肺癌患者的尿液蛋白质组表达,以寻找差异表达蛋白质,从而发现可用于非小细胞肺癌早期筛查、监测预后和治疗评估的生物标记物。最后,期望能达到针对非小细胞肺癌患者寻找一个强有力的早期筛查方法,以提高早期非小细胞肺癌确诊率的目的。方法:本研究以200000×g超高速离心沉淀法进行非肿瘤组和非小细胞肺癌患者组的尿液样本分离,提取其尿液蛋白质,并运用0.9%1D SDS-PAGE对部分尿液蛋白质进行再分离后分组。对凝胶条带脱色、还原及烷基化、选取目标胶带,应用乙腈、胰蛋白酶进行蛋白质凝胶内消化和萃取。消化后的蛋白质及肽段混合物进一步使用MS-Thermo-Orbitrap-Velos分析仪对蛋白质及肽段逐一予以鉴定识别,所得质谱数据应用MASCO软件通过NCBI-Human数据库进行数据分析,鉴定提取出尿液中所包含的所有蛋白质。同时,通过数据搜索和分析得到相关差异表达蛋白质,初步确定出非小细胞肺癌早期筛查的候选生物学标记物。最后,选取临床病理证实的10例NSCLC患者和10例非肿瘤人群的尿液样本进行实验验证,以明确所选非小细胞肺癌候选生物标记物的敏感性和特异性。从而最终确定出与临床NSCLC相关的生物学标志物以及进行临床筛查和诊断的优化模式。结果:非小细胞肺癌患者组和非肿瘤组尿液蛋白质在0.9%1D SDS-PAGE中差异性表达主要集中表现于90k Da、60k Da和20k Da-30k Da凝胶条带中。非小细胞肺癌组鉴定出蛋白质数1194-2813,平均值2001±363.1;对照组鉴定出蛋白质数1313-2740,平均值1967±505.0。其中在NSCLC患者尿液蛋白质中确定出4种差异表达蛋白质,包括上调蛋白LRG1、CA1和下调蛋白VPS4B、YWHAZ。而这四种差异表达蛋白在作为非小细胞肺癌独立生物标记物筛查模式时,其敏感性较低,但采用这4种差异蛋白质组合筛查模式对NSCLC进行筛查和诊断,其敏感性得到明显提高。结论:1、尿液是一种携带有多种蛋白质、多肽和氨基酸的生物流体,并且因尿液蛋白质检测具有取材容易、无损伤、灵敏、特异等优点。因此,检测尿液蛋白质组成,对肿瘤性疾病的早期诊断、疾病进程及预后判断具有重要价值。2、在非小细胞肺癌患者尿液蛋白质分析中LRG1、CA1蛋白质的表达与NSCLC发生、发展呈正相关,而VPS4B、YWHAZ蛋白质的表达与NSCLC发生、发展呈负相关。但均提示有可能成为用于NSCLC早期筛查、监测预后和治疗评估的生物标记物。3、LRG1、CA1、VPS4B和YWHAZ蛋白质作为单一生物标记物应用于NSCLC的筛查和诊断其敏感性较低。而采用生物标记物蛋白质组合模式筛查和诊断,其敏感性明显优于各自单一模式对NSCLC的筛查和诊断,故生物标记蛋白质组合模式在临床诊疗中将更具有良好的前景和实用价值。
【关键词】：尿蛋白质组学 非小细胞肺癌 十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 高效液相色谱 蛋白质芯片 质谱/质谱 胶内酶解
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语/符号说明10-12
• 前言12-14
• 研究现状、成果12
• 研究目的、方法12-14
• 一、样本收集、处理和尿蛋白质定量测定14-21
• 1.1 材料14-15
• 1.1.1 样本来源14-15
• 1.1.2 试剂与来源15
• 1.1.3 设备与来源15
• 1.1.4 所用软件15
• 1.2 方法15-18
• 1.2.1 溶液配制15-16
• 1.2.2 样本收集16-17
• 1.2.3 样本处理17
• 1.2.4 蛋白质提取17-18
• 1.2.5 蛋白质浓度测定18
• 1.3 结果18-19
• 1.3.1 尿液收集、处理和蛋白质分离18
• 1.3.2 尿液蛋白质定量测定18-19
• 1.4 讨论19-20
• 1.5 小结20-21
• 二、非小细胞肺癌患者尿蛋白质组的差异表达分析21-36
• 2.1 材料22-23
• 2.1.1 样本来源22
• 2.1.2 试剂与来源22
• 2.1.3 设备与来源22
• 2.1.4 所用软件22-23
• 2.2 方法23-25
• 2.2.1 溶液配制23
• 2.2.2 0.9% 1D SDS-PAG凝胶电泳蛋白质分离23-24
• 2.2.3 蛋白质胶内酶解24-25
• 2.2.4 差异表达蛋白质鉴定25
• 2.2.5 差异表达蛋白质敏感性和特异性分析25
• 2.2.6 差异表达蛋白质的验证实验25
• 2.3 结果分析25-32
• 2.3.1 0.9% 1D SDS-PAGE凝胶电泳与图像分析25-26
• 2.3.2 蛋白质质谱数据采集与分析26-28
• 2.3.3 差异蛋白质确定28-30
• 2.3.4 差异蛋白质敏感性、特异性结果分析30-32
• 2.3.5 验证实验结果分析32
• 2.4 讨论32-34
• 2.5 小结34-36
• 结论36-37
• 参考文献37-43
• 发表论文和参加科研情况说明43-44
• 综述 非小细胞肺癌早期分子生物学标记筛查现状44-66
• 综述参考文献54-66
• 致谢66

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本文编号：789346