RUNX3通过上调miR-29b表达来抑制胃癌增殖及迁移的分子机制

发布时间：2017-09-04 07:14

本文关键词：RUNX3通过上调miR-29b表达来抑制胃癌增殖及迁移的分子机制

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【摘要】：背景：胃癌在世界范围内是一种高发的恶性肿瘤,特别是在中国,胃癌的发病率高,预后差,病人的存活期限短,因此探讨胃癌发生发展的分子机制,寻找有效的诊断标志及治疗靶点是胃癌早期识别和干预的关键环节。RUNX3是Runt转录因子家族成员之一,其分子中含有高度保守的Runt结构域,Runt结构域可介导RUNX3蛋白与靶基因启动子区特定DNA结合元件的相互作用,从而调节靶基因的转录。目前研究认为,RUNX3是一种肿瘤抑制因子,可与TGF-P信号途径下游的Smad3/4相互作用,激活细胞周期抑制蛋白p21、促凋亡分子Bim等表达,从而促进细胞周期停滞及细胞凋亡；RUNX3还可直接靶向激活Claudin-1,抑制Aktl、VEGF等,从而抑制胃癌发生、转移及血管生成。但RUNX3作为一种转录因子能否通过调节非编码的microRNA表达来发挥其生物学功能目前尚不完全清楚。本论文中,我们首先用miRNA芯片筛查了RUNX3所调节的1miRNAs,发现RUNX3过表达后miR-29b上调最为显著,用生物信息学分析miR-29b的启动子,发现启动子区存在假定的RUNX3的结合位点,因此,我们选择miR-29b作为研究对象。我们用qRT-PCR验证了芯片结果,并探讨了RUNX3调节miR-29b表达的机制及RUNX3通过调节miR-29b影响细胞增殖及迁移的分子机制。目的：探讨RUNX3调节胃癌细胞中miR-29b表达的分子机制；解析miR-29b在胃癌中的生物学功能及其调控的下游靶基因；并阐明RUNX3能否通过调节miR-29b来抑制胃癌细胞的增殖及迁移。方法：1.将RUNX3过表达质粒及针对RUNX3的干扰siRNA及其相应的对照转染胃癌细胞,利用qRT-PCR检测不同转染对胃癌细胞中miR-29b表达的影响。2.利用染色质免疫共沉淀(ChIP)实验检测RUNX3蛋白与miR-29b启动子区相应结合元件在细胞内的相互作用。3.构建miR-29b启动子-荧光素酶报告基因载体及RUNX3结合位点发生突变的突变载体,利用荧光素酶活性检测实验检测RUNX3对miR-29b启动子活性的影响。4.将Smad3过表达质粒及相应的对照载体分别转染胃癌细胞,利用qRT-PCR及双荧光素酶活性检测实验分别检测Smad3对miR-29b表达的影响及对miR-29b启动子活性的影响。将RUNX3与Smad3过表达载体共转染胃癌细胞,荧光素酶活性检测RUNX3能否与Smad3协同增加miR-29b的启动子活性。5.用qRT-PCR检测RUNX3和miR-29b在胃癌和癌旁组织中的表达,统计学分析胃癌组织标本中RUNX3与niR-29b表达的相关性。6.在胃癌细胞中转染niR-29b mimics及inhibitor后,利用Transwell、EdU方法检测miR-29b对细胞增殖能力及侵袭转移的影响。7.将miR-29b mimics及inhibitor转染胃癌细胞,用qRT-PCR、Western blot等方法在胃癌细胞中检测miR-29b对靶基因DNMT3A、DNMT3B、KDM2A等表达的调控。构建靶基因3’-UTR荧光素酶报告基因载体及突变载体,利用荧光素酶活性检测实验检测miR-29b能否与靶基因3’-UTR直接结合。结果：1. RUNX3过表达质粒转染胃癌细胞后,miR-29b的表达水平明显升高；反之,RUNX3 siRNA转染细胞以干扰细胞中RUNX3的表达后, miR-29b的表达水平显著下降；而RUNX3的Runt结构域发生突变的突变载体转染细胞,miR-29b的表达水平没有明显改变。2. ChIP实验表明RUNX3可直接结合在miR-29b的启动子区；荧光素酶活性检测实验表明RUNX3可显著增加1miR-29b的启动子活性。3.在胃癌细胞中Smad3过表达可显著增加miR-29b的表达及启动子活性,RUNX3与Smad3共转染后可协同增加miR-29b的启动子活性。4.临床胃癌和癌旁组织检测表明：miR-29b在76%的胃癌组织中表达水平显著降低,统计学分析表明：miR-29b在胃癌组织中显著低表达,并且其表达水平与肿瘤大小、局部淋巴结转移等具有相关性,即：肿瘤越大,局部淋巴结转移越多的组织,miR-29b的表达水平越低。进一步统计分析发现：胃癌组织中RUNX3与miR-29b的表达水平呈显著正相关。5. miR-29b mimics转染胃癌细胞后,细胞的增殖及迁移能力均明显下降,反之,miR-29b inhibitor可以显著促进细胞的增殖及迁移。6.在胃癌细胞中,我们发现了1miR-29b调控的新靶点KDM2A, miR-29b可显著降低KDM2A的mRNA和蛋白水平,并且可以直接与KDM2A的Y-UTR区直接结合,从而抑制其表达。7.利用KDM2A特异的siRNA转染胃癌细胞,EdU和Transwell分别检测细胞的增殖及迁移能力,结果发现KDM2A siRNA转染可显著降低细胞的增殖及迁移能力；在转染miR-29b inhibitor的细胞中同时转染KDM2A siRNA可部分逆转miR-29b inhibitor转染造成的细胞增殖及迁移的升高。表明miR-29b对细胞增殖及迁移的影响部分通过调控KDM2A实现的。8.我们进一步检测了miR-29b是否参与RUNX3介导的生物学效应,将RUNX3表达载体转染胃癌细胞后,发现细胞的增殖及迁移能力均显著降低,在转染RUNX3的细胞中同时转染miR-29b inhibitor可部分逆转RUNX3过表达引起的生物学效应,即细胞的增殖及迁移能力得到部分回复。结论：在胃癌中RUNX3协同Smad3诱导1miR-29b的表达,miR-29b表达升高可通过靶向抑制KDM2A来抑制胃癌细胞的增殖及迁移,并且RUNX3可通过调节miR-29b/KDM2A抑制细胞增殖及迁移,该发现提供了一种RUNX3调节细胞生物学功能的新机制。
【关键词】：胃癌 RUNX3 miR-29b KDM2A
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2
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