RNA干扰人脂肪源性间充质干细胞KGF基因对胸腺上皮细胞增殖的体外研究

发布时间：2017-09-05 00:08

  本文关键词：RNA干扰人脂肪源性间充质干细胞KGF基因对胸腺上皮细胞增殖的体外研究

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【摘要】：目的:在血液科应用放化疗治疗血液肿瘤成为最主要的治疗途径,但是化疗及放疗相关的胸腺损伤比较常见,有文献报道,脂肪来源的间充质干细胞可以促进胸腺的修复,但是目前机制尚不能明确,但有文献指出脂肪源性间充质干细胞可以分泌角质细胞生长因子,而这种因子可以与位于胸腺上皮细胞的受体结合,进而促进胸腺上皮的增殖,本实验旨在研究,在体外条件下,脂肪干细胞修复放化疗损伤的胸腺的修复有可能是通过角质细胞生长因子实现的。方法:在无菌环境下分离提取人的皮下脂肪组织,应用眼科剪将其剪碎至1mm3小组织块,应用I型胶原酶及胰蛋白酶对其进行消化,制成单细胞悬液,按照一定细胞浓度分装于若干培养瓶中,加入适量含有20%胎牛血清的DMEM/F12培养基于标准环境下进行培养,定期换液,观察原代细胞形态。应用流式细胞术对干细胞进行鉴定。首先筛选使KGF基因沉默的最佳siRNA序列。应用si RNA target Designer设计软件,选择评分最高的交予锐博公司构建KGF-siRNA-1、KGF-siRNA-2、KGF-siRNA-3、empty-si RNA四组siRNA,分别应用Lipofectamine RNAiMAX瞬转的方式转染人的脂肪源性间充质干细胞,将转染后的人脂肪源性间充质干细胞分为5组即KGF-siRNA-1组、KGF-siRNA-2组、KGF-siRNA-3组、empty-si RNA 4组以及空白对照组,有文献指出在48小时后转染效率最高,遂在培养箱内培养48小时后观察细胞生长良好,应用QT—PCR筛选最佳序列。通过筛选,发现序列3(KGF-siRNA-3)沉默效率最佳,进一步筛选KGF-siRNA-3使人脂肪源性间充质干细胞基因沉默的最佳浓度,分别应用Lipofectamine RNAi MAX瞬转的方式转染人的脂肪源性间充质干细胞,在标准培养箱培养48小时,分为6组:组一:20umol/L、组二:30umol/L、组三:50 umol/L、组四:100umol/L、组五:空质粒组、组六:空白对照组,、有文献指出在48小时后转染效率最高,遂在培养箱内培养48小时后观察细胞生长良好,应用qt—pcr筛选最佳浓度。应用western-blot检测kgf基因沉默后48h及72h角质细胞生长因子的表达。诱导脂肪间充质干细胞向脂肪细胞转化,并通过brdu增殖实验对kgf基因沉默后的脂肪间充质干细胞进行鉴定。将kgf基因沉默后的人脂肪源性间充质干细胞与人及小鼠的胸腺上皮细胞株在transwell小室进行共培养(人脂肪源性干细胞位于小室的下层,胸腺上皮细胞位于小室上层)作为基因沉默组,将kgf基因正常表达的人脂肪源性间充质干细胞与人及小鼠的胸腺上皮细胞株在transwell小室进行共培养(方法同前)作为基因正常表达组,同时设单纯人及鼠胸腺上皮细胞株培养组,应用brdu增殖实验测定胸腺上皮细胞增殖,近一步通过pi(碘化丙啶)单染的方法分析胸腺上皮细胞的细胞周期。结果:1培养人脂肪源性间充质干细胞6-8d后,细胞呈比较典型的纤维状,10-12d后铺满瓶底约90%左右。传代后选取对数生长期细胞,用流式细胞仪检测细胞表面抗原cd44阳性率93.7%,cd34阳性率为0.405%。2qt—pcr结果显示:与空质粒组相比,转染48小时kgf-sirna-1、kgf-sirna-2、kgf-sirna-3的人脂肪源性间充质干细胞内kgfmrna水平分别下降了46.88%、30.12%、81.88%,其中kgf-sirna-3对kgfmrna的干扰作用最明显(p0.05),而空载体转染组和未转染组比较,差异无显著性(p0.05)。3进一步筛选kgf-sirna-3使人脂肪源性间充质干细胞基因沉默的最佳浓度,realtimepcr结果显示:转染48小时kgf-sirna-3(0.2ug)、kgf-sirna-3(0.3ug)、kgf-sirna-3(0.5ug)、kgf-sirna-3(1.0ug)的人脂肪源性间充质干细胞mrna水平分别下降了33.22%、46.40%、81.06%、42.35%,其中kgf-sirna-3(0.5ug)转染组对kgfmrna表达干扰效果最明显(p0.05),而空载体转染组和未转染组比较,差异无显著性(p0.05)。4rna干扰kgf基因沉默后,48小时检测角质细胞生长因子表达,在基因沉默组、空白对照组、空质粒组分别为(0.223±0.007)、(0.881±0.009)、(0.894±0.004),空白对照组蛋白表达与空质粒组无显著性差异,p0.05,基因沉默组蛋白表达较空质粒对照组下降76.17%,p0.05,。72小时在各组的表达为(0.184±0.008)、(0.916±0.006)、(0.931±0.005),空白对照组蛋白表达与空质粒组无显著性差异,p0.05,基因沉默组蛋白表达较空质粒对照组下降80.24%,p0.05。5对基因沉默的脂肪干细胞进行鉴定,诱导成脂结果显示诱导14天的人脂肪源性间充质干细胞油红o染色阳性,应用brdu方法测定结果显示脂肪干细胞连续增殖。6应用brdu增殖实验分别测定基因沉默组,基因正常表达组及单纯人胸腺上皮细胞株培养组胸腺上皮细胞增殖情况:第1天各组增殖情况为(24.6±0.7)%、(38.3±0.7)%、(18.6±0.5)%,第2天各组增殖情况为(34.8±0.6)%、(46.1±0.6)%、(28.9±0.3)%,第3天各组增殖情况为(40.6±0.5)%、(52.4±0.8)、(35.5±0.4)%,结果显示基因正常表达组的增殖高于基因沉默组,p0.05,有统计学差异。7应用brdu增殖实验分别测定基因沉默组,基因正常表达组及单纯鼠胸腺上皮细胞株培养组胸腺上皮细胞增殖情况:第1天各组增殖情况为(21.7±0.2)%、(36.8±0.6)%、(19.1±0.6)%第2天各组的增殖情况为(30.4±0.4)%、(45.8±0.7)%、(24.9±0.6)%第3天各组增殖情况为(35.9±0.7)%、(51.8±0.6)%、(31.5±0.3)%,结果显示基因正常表达组的增殖高于基因沉默组,p0.05,有统计学差异。8应用pi单染分别测定基因沉默组、基因正常表达组及单纯人胸腺上皮细胞株培养组胸腺上皮细胞的细胞周期,计算与细胞增殖密切相关的s期细胞所占比例:第1天各组s期细胞所占比例为(24.6±0.7)%、(38.3±0.7)%、(18.6±0.5)%,第2天各组s期细胞所占比例为(34.8±0.6)%、(46.1±0.6)%、(28.9±0.3)%,第3天各组s期细胞所占比例为(40.6±0.5)%、(52.4±0.8)%、(35.5±0.4)%,结果显示第1~3天,基因正常表达组的s期细胞所占比例均高于基因沉默组,p0.05,有统计学差异。9应用pi单染分别测定基因沉默组、基因正常表达组及单纯鼠胸腺上皮细胞株培养组胸腺上皮细胞的细胞周期,计算与细胞增殖密切相关的s期细胞所占比例:第1天各组s期细胞所占比例为(23.6±0.6)%、(37.3±0.7)%、(19.6±0.7)%,第2天各组S期细胞所占比例为(25.9±0.6)%、(45.1±0.6)%、(28.9±0.4)%,第3天各组S期细胞所占比例为(40.9±0.5)%、(53.4±0.8)%、(35.5±0.2)%,结果显示第1~3天,基因正常表达组S期细胞所占比例均高于基因沉默组,P0.05,有统计学差异。结论:1、脂肪源性间充质干细胞可以促进胸腺上皮细胞增殖,这种增殖作用可能是通过分泌角质细胞生长因子完成的2、脂肪源性间充质干细胞对放化疗损伤的胸腺可能存在修复作用。
【关键词】：人脂肪源性间充质干细胞 siRNA RNAi 角质细胞生长因子 基因沉默增殖
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.5
【目录】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-14
• 第一部分 脂肪干细胞的分离、培养及鉴定14-23
• 前言14-15
• 材料与方法15-18
• 结果18-19
• 附图19-20
• 讨论20-21
• 小结21-22
• 参考文献22-23
• 第二部分 敲除人脂肪源性间充质干细胞KGF基因对胸腺上皮细胞增殖的影响23-59
• 前言23-24
• 材料与方法24-36
• 结果36-38
• 附图38-52
• 讨论52-55
• 小结55-56
• 参考文献56-59
• 结论59-60
• 综述 角质细胞生长因子研究进展60-70
• 参考文献66-70
• 致谢70-71
• 个人简历71

【参考文献】

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1 ;Protective effects of Rheum tanguticum polysaccharide against hydrogen peroxide-induced intestinal epithelial cell injury[J];World Journal of Gastroenterology;2005年10期

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本文编号：794642