miR-503靶基因PRKACA的鉴定及其在食管鳞癌细胞中的生物学功能

发布时间：2017-09-06 00:33

  本文关键词：miR-503靶基因PRKACA的鉴定及其在食管鳞癌细胞中的生物学功能

  更多相关文章： 食管鳞癌 mi R-503 PRKACA 靶基因

【摘要】：目的:检测应激条件下mi R-503的表达;鉴定mi R-503的靶基因PRKACA;研究PRKACA基因编码的蛋白对食管鳞癌细胞Eca9706和Eca109功能的影响及其生物学机制。方法:1、分别在缺糖、缺氧及饥饿条件下培养Eca109和Eca9706细胞,采用Taqman探针法检测mi R-503的表达情况。2、体外设计并合成3组干扰PRKACA mRNA表达的siRNA,采用脂质体法转染食管鳞癌细胞株Eca109和Eca9706。3、Western Blot方法检测转染PRKACA-siRNA后Eca109的PRKACA蛋白的表达水平,评估干扰效果。4、通过CCK-8试剂盒检测干扰PRKACA基因表达后Eca109和Eca9706细胞增殖能力的改变。5、Transwell侵袭实验法检测PRKACA对Eca109和Eca9706细胞的侵袭转移能力的影响。6、利用流式细胞术分析PRKACA基因对Eca109和Eca9706细胞周期的影响。7、将mi R-503mimics及mi R-503 negative control分别转染Ec a109,之后采用偶联AGO2抗体的beads来免疫沉淀mi RNA-m RNA-AGO2蛋白复合体,而在另一组实验中采用Ig G替换AGO2抗体,然后都用TRizol法来抽提沉淀的总RNA,最后实时定量PCR法检测PRKACA m RNA的表达。8、扩增PRKACA 3’-UTR的种子区及突变种子区,且在两端加上SpeⅠ和HindⅢ酶切位点后构建至双荧光素酶报告质粒pMIR-PRKACA和pmir-prkaca-mutant;将mir-503mimics、mir-503negativecontrol、pmir-prkaca和pmir-prkaca-mutant,分别共转染hek293细胞;裂解细胞后加入底物,检测荧光素酶活性。9、通过生物信息学方法即go基因分类法、keggpathways法预测mir-503在食管鳞癌中靶基因。10、统计学分析:所有实验数据均使用spss17.0统计软件包,两指标间的比较采用lsd-t检验,两项以上的采用单因素方差分析;计量资料采用t检验;差异性分析用配对χ2检验;相关性检验用spearman相关分析,以α=0.05为标准。结果:1、taqman探针法结果表明,在缺糖、缺氧及饥饿条件下,eca109和eca9706中的mir-503的表达水平显著升高;2、sirna转染eca109细胞,分别命名为prkaca-sirna-eca109-1、prkaca-sirna-eca109-2、prkaca-sirna-eca109-3和sirna-nc组,经过48h的培养,使用westernblot筛选对prkaca基因表达干扰效果最好的sirna。3、转染sirna-prkaca后48h,与对照组比较的结果显示,prkaca-sirna-eca109-3组的prkaca蛋白的表达水平明显降低(p0.05),显示干扰sirna序列能够显著下调prkaca的表达,同时vimentin表达相对下调,e-cadherin表达升高,cyclind1和cycline1蛋白的表达水平降低。4、cck-8实验结果显示,prkaca基因抑制组食管鳞癌细胞增殖速度减慢(p0.05),对照组细胞的增殖速度加快(p0.05)。表明prkaca能够促进食管鳞癌细胞的增殖;5、transwell实验检测干扰组食管鳞癌细胞。迁移实验,eca109的mimics组镜下细胞数是55个,eca9706(x100)的mimics组为82个;侵袭实验,eca109及eca9706的mimics组分别为47、51个;两个细胞株的两组实验相较对照组都有显著性差异(p0.05)。说明prkaca基因的表达能够促进eca109及eca9706细胞的侵袭转移。6、流式细胞检测sirna-prkaca阳性的eca细胞。eca109组g0/g1细胞比例61.47%,s期比例20.95%,g2/m期17.58%;eca9706组g0/g1细胞比例68.18%,s期比例17.61%,g2/m期14.21%;两组细胞与对照组比较均有显著性差异(p0.05)。表明prkaca基因的抑制可以导致食管鳞癌细胞g1期的阻滞。7、通过go基因分类法、keggpathways法发现与mir-503紧密相关的prkcg、prkaca、rictor、smad7、wnt4及wnt3a,都可能是mir-503的靶基因。8、rip实验显示,mir-503mimics组prkacamrna的表达水平显著高于mir-503negativecontrol组(p0.05),推测prkaca是mir-503的靶基因。9、实验组中荧光素酶活性相比对照组显著降低(p0.05),显示mir-503mimics对pmir-prkaca的荧光素酶表达有抑制作用,提示prkaca是mir-503的靶基因;mir-503mimics和pmir-prkaca-mutant共转染组荧光强度显著降低,而对照组无显著改变,说明mir-503mimics对pmir-prkaca-mutant表达有抑制作用,表明prkaca是mir-503的靶基因。结论:1.说明缺氧、缺糖及饥饿是诱发食管鳞癌细胞mir-503表达升高的重要因素。2.sirna干扰prkaca蛋白,提示prkaca具有促进食管鳞癌细胞的增殖、侵袭及迁移的作用。3.通过生物学预测,prkcg、prkaca、rictor、smad7、WNT4及WNT3A可能为miR-503的靶基因。4.RNA免疫共沉淀及双荧光素酶活性实验显示mi R-503的候选靶基因为PRKACA,且靶向抑制PRKACA的表达。5.miR-503及PRKACA基因的可作为判断食管鳞癌患者预后的一个潜在的预测指标。
【关键词】：食管鳞癌 mi R-503 PRKACA 靶基因
【学位授予单位】：四川医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.1
【目录】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-15
• 材料与方法15-33
• 结果33-50
• 讨论50-58
• 结论58-59
• 参考文献59-69
• DNA甲基化在食管癌防治中的研究（综述）69-75
• 参考文献72-75
• 英汉缩略词对照表75-77
• 致谢77-78

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 Antonia Digklia;Ioannis A Voutsadakis;;Targeted treatments for metastatic esophageal squamous cell cancer[J];World Journal of Gastrointestinal Oncology;2013年05期

，

本文编号：801149