miR-155-5p调控骨髓间质干细胞向胃癌间质干细胞转分化的作用及机制研究

发布时间：2017-09-08 01:20

  本文关键词：miR-155-5p调控骨髓间质干细胞向胃癌间质干细胞转分化的作用及机制研究

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【摘要】：目的:阐明骨髓间质干细胞(BM-MSC)向胃癌间质干细胞(GC-MSC)转分化的分子调控机制,基于胃癌微环境探寻胃癌治疗新靶标。方法:采用免疫荧光检测α-SMA、FAP的表达,定量PCR检测细胞因子的表达,Transwell迁移实验和侵袭实验检测胃癌细胞迁移及侵袭能力的改变,应用克隆形成实验和裸鼠皮下致瘤实验检测胃癌细胞增殖能力的改变来确定BM-MSC与GC-MSC表型和功能的差异。通过定量PCR检测比较BM-MSC与GC-MSC中miR-155-5p表达的差异。运用miR-155-5p micmis在GC-MSC中上调miR-155-5p的表达,miR-155-5p inhibitor在BM-MSC中下调miR-155-5p的表达,分析MSC表型、功能的变化,确定miR-155-5p对BM-MSC向GC-MSC转分化的调控作用。采用picTar和TargetScan软件预测和荧光报告素酶基因检测验证并确定miR-155-5p调控的靶基因。采用靶基因干扰片段或抑制剂与miR-155-5p inhibitor共转染BM-MSC,检测其表型和功能的变化,阐明miR-155-5p调控BM-MSC向GC-MSC转分化的分子机制。采用免疫组织化学方法分别检测弥散型、肠型胃癌组织标本和胃炎标本MSC中靶基因的表达,分析靶基因与胃癌分型的关系。从胃癌及癌旁组织中分离培养出GC-MSC与GCN-MSC,Western blot检测靶基因的表达差异。采用靶基因抑制剂或下游效应分子干扰片段处理GC-MSC,检测其表型和功能的改变,阐明miR-155-5p调控的相关信号分子维持GC-MSC的表型和功能的作用及机制。结果:GC-MSC与BM-MSC相比,具有更强的基质细胞活化表型和促进胃癌细胞增殖和转移的能力。miR-155-5p在GC-MSC中低表达,BM-MSC转染miRNA-155-5p inhibitor后可获得GC-MSC样表型和功能,相反,运用miR-155-5p mimics上调GC-MSC中mi RNA-155-5p的表达可削弱其表型和对胃癌细胞的作用。NF-kappa B p65(NF-κB p65)和inhibitor of NF-kappa B kinase subunit epsilon(IKBKE/IKKε)被预测并验证为miR-155-5p的靶基因。使用si-NF-κB p65或si-IKBKE作用于BM-MSC可以抑制miR-155-5p inhibitor对其转分化的调控作用,这种作用也可以被NF-κB p65活化抑制剂PDTC所抑制。IKBKE、NF-κB p65和phospho-NF-κB p65在弥散型胃癌组织MSC中的表达高于肠型胃癌组织MSC,阳性率分别为83.5%、80.8%和65.0%,而它们在胃炎组织MSC中几乎不表达,阳性率仅为19.3%,0%和4%。miR-155-5p在GC-MSC中表达下调,而NF-κB p65表达上调且活化增加,抑制NF-κB p65的活化或其下游关键效应因子的表达可以逆转GC-MSC的表型和功能。结论:GC-MSC较BM-MSC具有更强的促癌表型、功能和低表达miR-155-5p。BM-MSC中miR-155-5p的低表达可上调IKBKE和NF-κB p65的表达并促进NF-κB p65的活化,进而促进其获得GC-MSC样表型和功能,靶向抑制GC-MSC中NF-κB p65的活化或下游效应因子的表达可逆转其促癌表型和功能。为GC-MSC在胃癌微环境中的重塑提供了新的机制,也为胃癌的治疗提供了有效靶点和治疗途径。
【关键词】：miR-155-5p 骨髓间质干细胞 胃癌间质干细胞 肿瘤微环境 转分化
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-16
• 第一章 绪论16-25
• 1.1 MSC与肿瘤微环境16-19
• 1.1.1 肿瘤微环境的组成16
• 1.1.2 MSC参与肿瘤微环境的形成16-18
• 1.1.3 MSC与癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast, CAF)18-19
• 1.2 miRNA与肿瘤微环境19-21
• 1.2.1 miRNA与肿瘤微环境19-20
• 1.2.2 miR1555p与肿瘤微环境20-21
• 1.3 研究目的、方法、技术路线及意义21-25
• 1.3.1 研究目的21
• 1.3.2 研究方法21
• 1.3.3 实验方案21-23
• 1.3.4 预期结果及研究意义23-25
• 第二章 GC-MSC与BM-MSC表型和功能差异25-37
• 2.1 材料25-28
• 2.1.1 标本的采集25
• 2.1.2 主要试剂25-27
• 2.1.3 主要仪器及相关耗材27
• 2.1.4 细胞株27-28
• 2.1.5 实验动物28
• 2.2 方法28-33
• 2.2.1 BM-MSC的分离培养28
• 2.2.2 GC-MSC与GCN-MSC的分离培养28
• 2.2.3 MSC表面标记鉴定28-29
• 2.2.4 成骨细胞诱导29
• 2.2.5 成脂细胞诱导29
• 2.2.6 细胞培养29
• 2.2.7 MSC上清的制备29-30
• 2.2.8 免疫荧光30
• 2.2.9 mRNA的提取30
• 2.2.10 mRNA逆转录30-31
• 2.2.11 mRNA荧光实时定量PCR31
• 2.2.12 克隆形成实验31
• 2.2.13 transwell迁移实验31-32
• 2.2.14 transwell侵袭实验32
• 2.2.15 裸鼠皮下致瘤模型32
• 2.2.16 统计学分析32-33
• 2.3 结果33-35
• 2.3.1 BM-MSC、GC-MSC与GCN-MSC的鉴定33-34
• 2.3.2 BM-MSC与GC-MSC表型的差异34
• 2.3.3 BM-MSC与GC-MSC功能的差异34-35
• 2.4 讨论35-37
• 第三章 miR1555p的下调促进BM-MSC向GC-MSC转分化37-45
• 3.1 材料37
• 3.1.1 主要试剂37
• 3.2 方法37-40
• 3.2.1 寡核苷酸片段配置38
• 3.2.2 细胞转染38
• 3.2.3 miRNA的提取38-39
• 3.2.4 miRNA逆转录39
• 3.2.5 miRNA荧光实时定量PCR39-40
• 3.3 结果40-43
• 3.3.1 miR1555p在GC-MSC中表达下调40
• 3.3.2 miR1555p的下调促进BM-MSC获得GC-MSC样表型40-41
• 3.3.3 miR1555p的下调促进BM-MSC获得GC-MSC样功能41-43
• 3.4 讨论43-45
• 第四章 miR1555p的下调靶向激活NF-κB p65促进BM-MSC向GC-MSC转分化45-61
• 4.1 材料45-46
• 4.1.1 主要试剂45-46
• 4.1.2 主要仪器及相关耗材46
• 4.1.3 细胞株46
• 4.2 方法46-51
• 4.2.1 靶基因预测46
• 4.2.2 靶基因报告基因载体的构建46-49
• 4.2.3 报告基因载体转染49
• 4.2.4 启动子报告基因载体的构建与转染49
• 4.2.5 报告基因检测49
• 4.2.6 细胞蛋白提取49-50
• 4.2.7 Western blot50
• 4.2.8 si-RNA的转染50
• 4.2.9 PDTC的配制50-51
• 4.2.10 统计学分析51
• 4.3 结果51-59
• 4.3.1 miR1555p靶向调控NF-κB p6551-52
• 4.3.2 si-NF-κB p65对BM-MSC转分化作用的影响52-54
• 4.3.3 miR1555p的下调促进NF-κBp65的活化54-55
• 4.3.4 PDTC对BM-MSC转分化作用的影响55-56
• 4.3.5 miR1555p靶向调控IKBKE56-57
• 4.3.6 si-IKBKE对BM-MSC转分化作用的影响57-59
• 4.4 讨论59-61
• 第五章 GC-MSC表型和功能的维持依赖于NF-κB p65的持续活化61-71
• 5.1 材料61-62
• 5.1.1 主要试剂61-62
• 5.1.2 主要仪器及相关耗材62
• 5.1.3 细胞株62
• 5.2 方法62-63
• 5.2.1 免疫组织化学62-63
• 5.2.2 si-RNA转染63
• 5.3 结果63-69
• 5.3.1 胃癌标本中IKBKE、NF-κB p65、phospho-NF-κB p65的表达63-65
• 5.3.2 PDTC对GC-MSC的作用65-67
• 5.3.3 NF-κB p65下游通路的活化对GC-MSC的作用67-69
• 5.4 讨论69-71
• 第六章 结论和展望71-73
• 6.1 结论71
• 6.2 展望71-73
• 参考文献73-80
• 致谢80-81
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文及参加会议81

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