B7-H4在肿瘤细胞内表达的生物学意义研究

发布时间：2017-09-08 05:46

  本文关键词：B7-H4在肿瘤细胞内表达的生物学意义研究

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【摘要】：B7-H4,又称B7x和B7S1,是B7家族共刺激分子成员之一,并且能够抑制T细胞的免疫功能。B7-H4分子mRNA在人体外周组织中广泛表达,而其蛋白在正常机体内则不表达或低表达,在众多肿瘤细胞中则呈高表达。此外,研究发现B7-H4的表达水平与疾病的恶化呈正相关。早期研究发现,B7-H4分子属于I型跨膜糖蛋白,与淋巴细胞表面的相应受体结合,从而负性调控免疫反应。然而在一些肿瘤细胞中同样发现了B7-H4在胞内的表达。临床组织样本的分析结果显示,膜表达B7-H4与肿瘤浸润T淋巴细胞呈负相关,而胞内表达B7-H4分子与肿瘤浸润T淋巴细胞无明显相关性,由此可见,胞内B7-H4分子有区别于膜表达B7-H4分子的生物学功能。近期研究表明,B7-H4分子含有核定位序列,能够穿梭于细胞核与细胞质之间;并且位于核内的B7-H4分子能够促进细胞增殖、G1/S期的转换。但是,对于B7-H4分子在肿瘤细胞内表达的生物学意义仍不十分清楚。本研究通过构建Flag标签的B7-H4野生型(B7-H4 WT)真核表达载体,瞬转HEK293细胞,采用免疫共沉淀结合质谱的方法,寻找B7-H4分子在细胞内的相互作用蛋白;并通过基因芯片的方法分析构建的B7-H4野生型(B7-H4 WT)与核定位序列突变B7-H4(B7-H4 H250Q)的稳转细胞株,从而寻找B7-H4 WT与B7-H4 H250Q分子所引起的差异表达蛋白,更好地研究B7-H4在肿瘤细胞内表达的生物学意义。本论文主要包括以下两部分内容:一、免疫共沉淀结合质谱法寻找B7-H4分子相互作用蛋白及其生物学功能的初步研究【目的】寻找B7-H4分子相互作用蛋白,并对其生物学功能进行初步研究。【方法】构建Flag标签的B7-H4野生型真核表达载体,通过lipofectamine2000瞬转HEK293,24-48h提取总蛋白,免疫共沉淀法获得与B7-H4分子相互作用的蛋白,将相互作用蛋白跑WB并银染,差异条带胶回收,打质谱,分析数据,寻找相互作用蛋白,免疫共沉淀验证相互作用蛋白;以及通过构建vector/786-O、B7-H4 WT/786-O、B7-H4 H250Q/786-O以及vector/293、B7-H4 WT/293、B7-H4 H250Q/293稳定转染细胞株进行相应功能实验。【结果】构建了Flag标签的B7-H4野生型质粒,以及vector/786-O、B7-H4WT/786-O、B7-H4 H250Q/786-O以及vector/293、B7-H4 WT/293、B7-H4 H250Q/293稳定转染细胞株;免疫共沉淀结合质谱找到了野生型B7-H4分子的相互作用蛋白,并且发现B7-H4分子对相互作用蛋白的活性有调控作用。【结论】确定了B7-H4分子的互作蛋白DNA-PKcs,并初步证实B7-H4对该蛋白的活性有调控作用。二、寻找B7-H4野生型(B7-H4 WT)及核定位序列突变型(B7-H4 H250Q)在786-O细胞中的差异表达蛋白及其功能研究【目的】寻找B7-H4分子引起的差异表达蛋白,并对其生物学功能进行研究。【方法】通过基因芯片技术对上述构建的vector/786-O、B7-H4 WT/786-O、B7-H4H250Q/786-O稳定转染细胞株进行分析,寻找差异表达基因,Western blot实验验证差异表达蛋白,MTT细胞增殖实验比较体外细胞增殖率的差异。【结果】Western blot结果与基因芯片结果均发现一些与细胞侵袭及血管生成相关的差异表达蛋白,MTT增殖实验则表明B7-H4 WT增殖率要高于vector及B7-H4H250Q。【结论】野生型B7-H4分子能够促进肿瘤细胞的增殖,并且能够上调一些与细胞侵袭及血管生成密切相关的蛋白的表达,并且这一作用是由其核定位序列所介导的。
【关键词】：B7-H4 相互作用蛋白 差异表达蛋白 核定位序列
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• abstract6-10
• 引言10-12
• 第一部分 免疫共沉淀结合质谱法寻找B7-H4分子相互作用蛋白及其生物学功能的初步研究12-29
• 1 材料12-14
• 1.1 主要试剂12-13
• 1.2 主要溶液的配置13-14
• 1.3 实验仪器14
• 1.4 实验细胞、质粒及菌株14
• 2 实验方法14-20
• 2.1 细胞培养14-15
• 2.2 重组Flag标签质粒载体的构建15-17
• 2.3 重组质粒瞬转HEK293细胞17
• 2.4 免疫共沉淀（CoIP）寻找相互作用蛋白17-18
• 2.5 银染法寻找B7-H4相互作用蛋白18
• 2.6 差异蛋白胶内酶解18-19
• 2.7 慢病毒法构建B7-H4稳转细胞株19
• 2.8 嘌呤霉素最适作用浓度的筛选19
• 2.9 博来霉素zeocin作用浓度的筛选19-20
• 3 实验结果20-26
• 3.1 pCMV-Tag2B-B7-H4 WT重组质粒的鉴定20-21
• 3.2 免疫共沉淀（CoIP）结果21-22
• 3.3 差异条带银染结果22
• 3.4 质谱结果22-23
• 3.5 免疫共沉淀验证相互作用23
• 3.6 稳转细胞株的构建23-25
• 3.7 博来霉素zeocin作用浓度的确定25-26
• 3.8 B7-H4分子对其相互作用蛋白DNA-PKcs活性的影响26
• 4 讨论26-29
• 第二部分 寻找B7-H4野生型及核定位序列突变型在 786O中的差异表达蛋白及其功能研究29-38
• 1 材料29-30
• 1.1 主要试剂29-30
• 1.2 主要仪器30
• 2 实验方法30-31
• 2.1 细胞培养30
• 2.2 Trizol法提取总RNA30-31
• 2.3 MTT细胞增殖实验31
• 2.4 统计学分析31
• 3 实验结果31-36
• 3.1 基因芯片结果31-33
• 3.2 蛋白水平检测差异基因表达33-35
• 3.3 MTT细胞增殖实验检测细胞增殖率35-36
• 4 讨论36-38
• 论文总结38-39
• 参考文献39-42
• 综述42-55
• 参考文献48-55
• 攻读学位期间公开发表的论文55-56
• 附录56-57
• 致谢57-58

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本文编号：812245