线粒体自噬在红系白血病细胞中的作用

发布时间：2017-09-08 10:26

  本文关键词：线粒体自噬在红系白血病细胞中的作用

  更多相关文章： ATG7 经典自噬 RAB9A 非经典自噬 线粒体自噬

【摘要】：目的:研究红系白血病细胞中,是否存在非经典自噬,以及非经典自噬在红系白血病细胞生长、分化和应激反应方面的作用,阐明其与经典自噬之间的关系,及其在线粒体降解过程中的作用,为理解白血病细胞的恶性生长优势提供细胞学新依据。方法:(1)通过使用CRISPR/Cas9技术,构建Atg7敲除的K562细胞系。(2)通过台盼兰染色细胞计数、Annexin V/PI流式染色(Flow Cytometry,FCM)和细胞集落分析K562细胞生长、增殖和分化能力的变化。(3)通过透射电镜技术TEM和线粒体染色流式分析Atg7-/-的K562细胞中线粒体、ROS的变化情况,同时确认在Atg7缺失的情况下,细胞中是否存在自噬体状结构。(4)使用线粒体自噬的诱导剂CCCP处理野生型和Atg7-/-K562细胞,通过线粒体流式染色和Western Blot技术检测细胞中线粒体数量的变化情况。(5)通过Western Blot技术检测非经典自噬的关键蛋白的表达量,分析Atg7-/-K562细胞中非经典自噬过程的状态。(6)使用非经典自噬抑制剂BFA和敲低非经典自噬关键基因RAB9A,分析当两种自噬同时受到抑制的情况下,线粒体自噬的发生情况。(7)使用Comet Assay和Western Blot技术检测在细胞在经历电离辐射的情况下,两种自噬在DNA修复过程中的作用。结果:(1)成功使用CRISPR/Cas9技术构建Atg7-/-K562细胞系。(2)Atg7的缺失会导致K562生长速度变慢,细胞周期阻滞在G2/M期以及分化潜能降低,但不会改变细胞中线粒体数量和ROS的水平。(3)在Atg7-/-K562细胞中,能够观察到双层膜包裹的自噬体状结构,同时,Atg7的缺失会导致非经典自噬通路的增强。(4)CCCP诱导的线粒体自噬的发生并不依赖于Atg7。(5)加入非经典自噬抑制剂BFA、敲低非经典自噬关键基因RAB9A,线粒体自噬不能正常的发生。(6)同时抑制经典自噬和非经典自噬,K562细胞在代谢压力的情况下,表现为细胞凋亡、ROS水平升高。(7)非经典自噬可能通过RAD50在DNA修复过程中发挥作用。结论:在红系白血病细胞系K562中,同时存在经典自噬和非经典自噬,当经典自噬被阻断后,非经典自噬起到一定程度的补偿作用。但同时,细胞内的一些重要事件,如线粒体自噬的发生主要通过非经典自噬。本研究从自噬的视角,理解白血病细胞的生长优势,为白血病的临床治疗提供了数据参考。
【关键词】：ATG7 经典自噬 RAB9A 非经典自噬 线粒体自噬
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.7
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 前言9-11
• 材料与方法11-21
• 一、材料11-13
• 二、方法13-21
• 实验结果21-32
• 一、敲除ATG7的K562细胞系构建21-22
• 二、ATG7敲除引起K562细胞G_2/M周期阻滞和分化能力减弱22-24
• 三、线粒体自噬的发生不依赖于ATG724-25
• 四、线粒体降解依赖于非经典型自噬25-30
• 五、非经典型自噬够控制ROS水平，降低细胞凋亡率，，促进DNA辐射损伤修复30-32
• 讨论32-34
• 参考文献34-39
• 综述：非经典自噬及线粒体自噬的研究进展39-47
• 参考文献43-47
• 硕士学位期间发表的论文47-48
• 附录48-49
• 中英文缩略词汇表49-51
• 致谢51-52

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本文编号：813486