来氟米特对肾癌细胞增殖和凋亡的影响

发布时间：2017-09-08 14:20

  本文关键词：来氟米特对肾癌细胞增殖和凋亡的影响

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【摘要】：背景：来氟米特(Leflunomide, LEF)为合成序号为HWA2486的异恶唑类药物,又名N-(4-三氟-甲苯)-5-甲基异嗯唑-4-咪唑羧酰胺,分子结构为C12H9F3N2O2,分子量270.2。是一种以治疗类风湿关节炎(RA)为主的抗增殖活性免疫抑制剂。丙二酸次氮酰胺(A771726)是LEF在细胞内发挥药效的代谢产物。A771726可逆地抑制二氢乳氢酸脱氢酶(DHODH)的活性,DHODH失活将影响活化淋巴细胞的嘧啶合成过程。除此之外,A771726还会抑制NF-κB的激活,影响黏附分子的表达,例如细胞间粘附因子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)和基质金属蛋白酶(MMP1)等。与某些抗肿瘤药物机制类似。我们推测LEF对肾癌细胞的增殖和凋亡可能具有一定的影响作用。研究内容：探究肾癌细胞用LEF处理后,其增殖和凋亡的变化情况。并深入分析LEF对肾癌细胞的作用机制。研究方法：肾癌细胞株786-0和Caki-2作为实验材料,用不同浓度的LEF(50、100、200gM)处理不同的时间(24、48、72 h),加0.1%的DMSO的组作为对照。1.LEF对肾癌细胞增殖的影响的检测采用MTS实验,EdU掺入实验和细胞克隆形成实验。LEF对肾癌细胞内相关周期蛋白的影响检测采用流式细胞仪检测细胞周期实验和蛋白印迹实验。2.LEF对肾癌细胞凋亡的影响检测采用流式细胞术检测细胞凋亡实验,LEF对肾癌细胞内相关凋亡蛋白的表达的影响的检测采用蛋白印迹实验,LEF对肾癌细胞自噬的影响的检测采用质粒转染实验。3.蛋白印迹实验,细胞免疫化学实验和实时荧光定量PCR实验分析LEF处理Caki-2细胞后,β-catenin, c-Myc, Wnt3a,Wnt1等的表达,采用蛋白印迹实验和流式细胞技术检测使用信号转导通路制剂或改变信号转导通路关键蛋白β-catenin的量后肾癌细胞对LEF敏感性的变化,采用基因芯片技术进一步检测和验证LEF对肾癌细胞内信号转导通路相关基因表达的影响。研究结果：1.LEF对肾癌细胞增殖的影响MTS实验结果表明,不同浓度的LEF作用于Caki-2细胞和786-0细胞48 h后,细胞活力都剂量依赖性降低,但Caki-2细胞对LEF的作用更为敏感。LEF浓度≥100μM时,细胞活力显著降低,并且具有时间依赖性。Caki-2细胞用不同浓度的LEF处理48 h后,用EdU掺入法检测DNA的合成,以检测细胞的增殖活力,结果显示,阳性细胞的数量以剂量依赖的方式显著减少。细胞克隆形成实验进一步显示,在药物处理过程中,LEF浓度超过50μM时几乎完全抑制细胞克隆的形成。LEF处理后,细胞内周期相关蛋白CyclinA, CyclinD1和CDK2表达下降,而作为CDK的抑制因子,p21蛋白表达增加,Caki-2细胞发生S期细胞周期阻滞。2.LEF引发肾癌细胞凋亡和自噬LEF能够介导肾癌细胞发生凋亡,在200μM的浓度下,凋亡最显著,此时PARP-1和Caspase-3出现了剪切片段。Bcl-2和APE/REF-1这些抗凋亡蛋白的表达降低,而另一抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达在药物处理后几乎不受影响,同时Bax作为促凋亡蛋白表达增加。此外,转染LC3-GFP质粒的Caki-2细胞经LEF处理后,原本弥漫的LC3-GFP在细胞质中成簇积累,呈现斑块状。表明细胞发生了自噬。在50μM的LEF组虽然不能观察到明显的细胞凋亡现象,却能观察到明显的自噬现象。蛋白印迹实验也检测到P62蛋白随LEF浓度增加而减少以及表达升高的自噬蛋白LC3-Ⅱ。3.LEF对肾癌细胞作用机制的研究结果(1)高浓度LEF影响Caki-2细胞内β-catenin的表达水平。这种影响主要表现为改变P-catenin蛋白的量,而不是其在mRNA水平上的表达。β-catenin基因下游的一个癌基因c-Myc,不但在蛋白水平上表达减少,在mRNA水平上表达也显著下调。除此之外,LEF处理Caki-2细胞一定的时间后,可以看到细胞内的β-catenin蛋白出核,并且在细胞质内呈现浓聚点状分布。以上这些实验数据充分表明了LEF可以在肾癌细胞内抑制经典Wnt/β-catenin信号转导通路的活化。(2)LEF与蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺(CHX)共同处理加强了Caki-2细胞内β-catenin蛋白的降解程度,泛素化抑制剂MG-132与LEF共处理Caki-2细胞,能够反转LEF对β-catenin蛋白表达的抑制作用,但自噬抑制剂HCQ却不能。说明在LEF处理后蛋白降解作用使Caki-2细胞内β-catenin蛋白数量降低。蛋白印迹实验表明,100μM和200μM的LEF处理有效地抑制了Caki-2细胞内AKT激酶的磷酸化。因此,LEF诱导β-catenin蛋白的降解可归因于AKT激酶的磷酸化被抑制。(3)LEF处理后Caki-2细胞内Wnt3a表达升高。Wnt1表达略有下降,Wnt5a表达基本不发生变化。Wnt信号的分泌抑制剂IWP-2与LEF联合处理Caki-2细胞能够增强LEF对细胞的毒性作用,即LEF和IWP-2共同处理极大地提高了Caki-2细胞的凋亡水平。LEF单独处理时,Caki-2细胞内相关蛋白β-catenin, c-Myc和CyclinD1的表达下降程度没有联合加药时大。所以,细胞可能在LEF处理后上调Wnt3a的表达来减少药物的毒性作用,即过表达Wnt3a来抗衡细胞的抑增殖和促凋亡作用。(4)基因芯片结果显示,100μM的LEF处理48 h以后,Caki-2细胞内Wnt受体FZD10的表达降低超过800倍,Fzdl和Fzd2的mRNA水平也有所降低。结论：LEF处理后,肾癌细胞生长变缓慢,同时发生了自噬和细胞凋亡,表现出了LEF对肾癌细胞的毒性作用。LEF之所以能够抑制肾癌细胞的生长,促进细胞的凋亡,可能是因为肾癌细胞内的经典Wnt/β-catenin信号转导途径被抑制了。高浓度LEF处理组细胞内β-catenin蛋白从细胞核出来,点状聚集在细胞质中,LEF抑制AKT激酶的磷酸化而使β-catenin蛋白水解,抑制经典Wnt/β-catenin信号转导通路的激活,LEF通过影响β-catenin的稳定性及其定位的变化,使细胞周期相关蛋白、Wnt/β-catenin信号转导通路受体蛋白FZD10,FZD2表达下降。但同时,高浓度的LEF又上调Wnt/β-catenin信号转导通路的配体Wnt3a在mRNA上的表达水平以抵抗LEF的抗增殖和促凋亡效应。高浓度的LEF可以通过抑制经典Wnt/β-catenin信号通路的活化,降低细胞活力,促进细胞发生凋亡。因此,LEF可能对肾癌有潜在的治疗作用。
【关键词】：Leflunomide 肾癌细胞 增殖 凋亡
【学位授予单位】：浙江师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.11
【目录】：

• 中文摘要4-8
• ABSTRACT8-15
• 缩略语及中英文对照15-16
• 综述 Wnt信号通路与肿瘤的关系16-24
• 1 Wnt信号途径16-18
• 1.1 Wnt信号通路主要成员16-17
• 1.2 Wnt信号通路主要活化方式17-18
• 1.2.1 Wnt经典通路17
• 1.2.2 Wnt非经典通路17-18
• 2 Wnt信号转导通路和癌症的关系18-21
• 3 Wnt3a在癌细胞中的表达21
• 4 Wnt3a抑制或促进癌细胞生长21-22
• 5 Wnt3a在体内影响肿瘤的生长22
• 6 Wnt3a在癌症的作用22-23
• 6.1 Wnt3a调节癌症内基因表达22-23
• 6.2 Wnt3a由基因/蛋白调节23
• 7 展望23-24
• 1 背景24-26
• 2 实验材料26-29
• 2.1 细胞株26
• 2.2 质粒26
• 2.3 主要药物、试剂及材料26-28
• 2.4 仪器与设备28-29
• 3 实验方法29-41
• 3.1 细胞培养与传代29-30
• 3.2 细胞的活力测定实验(MTS法)30
• 3.3 Edu掺入实验(EdU incorporation assay)30-31
• 3.4 细胞克隆形成实验(Colony formation assay)31-32
• 3.5 流式细胞仪检测细胞周期(Flow cytometry analysis)32
• 3.6 流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测细胞凋亡32-33
• 3.7 实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)33-35
• 3.8 蛋白免疫印迹(Western blot)35-37
• 3.9 细胞免疫荧光(Immunofluorescence)37-39
• 3.10 转染(DNA interfection)39
• 3.11 基因芯片(Gene Expression Microarray)39
• 3.12 质粒扩增39-40
• 3.13 统计学分析40-41
• 4 实验结果41-54
• 4.1 LEF对肾癌细胞的增殖抑制作用41-45
• 4.2 LEF对肾癌细胞凋亡和自噬的影响45-47
• 4.3 LEF对肾癌细胞作用机制的研究47-54
• 4.3.1 LEF抑制经典Wnt/β-catenin信号转导通路47-49
• 4.3.2 LEF通过抑制AKT的磷酸化诱导β-catenin蛋白的降解49-51
• 4.3.3 LEF上调Wnt3a维持经典Wnt/β-catenin信号转导途径51-53
• 4.3.4 LEF下调Fzd10表达53-54
• 5 讨论54-56
• 6 结论56-57
• 参考文献57-67
• 致谢67-68
• 攻读学位论文期间发表的学术论文目录68-70

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