miR-30a靶向EYA2基因对肺腺癌细胞恶性生物学表型的影响

发布时间：2017-09-08 22:21

  本文关键词：miR-30a靶向EYA2基因对肺腺癌细胞恶性生物学表型的影响

  更多相关文章： NSCLC miR-30a EYA2 迁移 侵袭

【摘要】：肺癌是中国癌症死亡的主要原因,其中非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌中常见的一种组织学类型,约占肺癌的80%左右,五年生存率仅为15%左右。目前对NSCLC的分子发病机制还知之甚少,还有待于更多的研究。 microRNAs (miRNAs)是一类进化上保守的非编码小RNA,在转录后水平微调基因的表达。越来越多的证据显示miR-30a可作为一个抑癌基因抑制多种肿瘤细胞的生长,在少数几种肿瘤细胞中还发现具有癌基因的特征。EYA2是eyes absent(EYA)蛋白家族成员之一,已报导能够促进乳腺癌细胞的侵袭、迁移、增殖和转化过程。然而,niR-30a和EYA2在NSCLC发生过程中的生物学功能和作用机制还未完全清楚。 本文通过Targetscan和miRanda预测,EYA2很可能是miR-30a作用的一个靶点；进一步采用免疫印迹(western blot)对EYA2在NSCLC细胞株中的表达水平进行了定量检测,发现EYA2仅在肺腺癌A549细胞中的表达水平显著上调；实时荧光定量PCR (qRT-PCR)对niR-30a在肺腺癌细胞和组织中的表达水平进行了检测,发现miR-30a在肺腺癌A549细胞和14例石蜡包埋的肺腺癌组织中的表达水平均显著下调；双荧光素酶报告基因实验以及在A549细胞和BEAS-2B细胞中转染miR-30a mimic和inhibitor验证了miR-30a直接作用于EYA2mRNA3' UTR而抑制其蛋白的表达水平；划痕实验(wound-healing assay)、 MTS细胞活力检测、Transwell细胞侵袭实验及流式细胞周期分析对miR-30a靶向EYA2是否能够影响A549细胞的恶性生物学表型做了初步评估,结果发现miR-30a过表达抑制了细胞的迁移和侵袭,对增殖和周期进程无影响,而EYA2siRNA对细胞的侵袭、迁移、增殖和周期进程都起到了显著的抑制作用。上述结果表明了niR-30a能够靶向调控肺腺癌A549细胞中EYA2蛋白的表达水平,且这种调控关系很可能与细胞迁移和侵袭相关,对增殖和周期进程无影响。
【关键词】：NSCLC miR-30a EYA2 迁移 侵袭
【学位授予单位】：云南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 主要~.略词简表9-10
• 第1章 前言10-23
• 1、肺癌概述10-13
• 1.1 肺癌流行病学10
• 1.2 肺癌分类与分期10-11
• 1.3 肺癌的遗传易感性11-12
• 1.4 肺癌的分子发病机制12-13
• 2、miRNA概述13-19
• 2.1 miRNA的命名13-14
• 2.2 miRNA的成熟过程及作用机制14
• 2.3 miRNA的定量检测14-15
• 2.4 miRNA靶基因的预测15
• 2.5 miRNA的功能分析15-16
• 2.6 miRNA与人类癌症16-17
• 2.7. miRNA与NSCLC17-19
• 3、EYA蛋白家族概述19-21
• 3.1 EYA蛋白的结构与活性19-20
• 3.2 EYA蛋白的细胞功能20
• 3.3 EYA蛋白与人类癌症20-21
• 4、本文立项依据21-23
• 第2章 材料与方法23-36
• 1、主要仪器设备23
• 2、主要实验试剂23-26
• 3、实验材料26-27
• 4、实验内容与方法27-35
• 4.1 细胞培养27-28
• 4.2 Western Blot检测细胞中靶基因的表达水平28-30
• 4.2.1 溶液配制28
• 4.2.2 western blot实验流程28-30
• 4.3 茎环引物(stem-loop primer)设计30
• 4.4 总RNA提取30-31
• 4.4.1 细胞总RNA提取30-31
• 4.4.2 组织总RNA提取31
• 4.5 qRT-PCR检测细胞和组织中miRNA的表达水平31
• 4.6 细胞瞬时转染31
• 4.7 双荧光素酶报告实验31-33
• 4.7.1 主要试剂配制31-32
• 4.7.2 质粒构建32-33
• 4.7.3 转染级别质粒抽提33
• 4.7.4 细胞培养与共转染33
• 4.7.5 双荧光素酶报告系统检测33
• 4.8 细胞恶性生物学表型的检测33-35
• 4.8.1 Wound-Healing实验检测细胞迁移33-34
• 4.8.2 基于PI染色的流式细胞周期分析34
• 4.8.3 MTS法检测细胞增殖34
• 4.8.4 Transwell实验检测细胞侵袭34-35
• 5、数据分析35-36
• 第3章 实验结果与分析36-50
• 1、预测miR-30a在EYA2 mRNA 3’UTR是否有互补结合位点36
• 2、Western Blot检测NSCLC细胞株中EYA2的蛋白水平36-37
• 3、qRT-PCR检测miR-30a在肺腺癌中的表达水平37-41
• 3.1 总RNA提取37-38
• 3.2 A549细胞和14例肺腺癌组织中miR-30a表达水平的实时荧光定量检测38-41
• 3.2.1 引物信息38-39
• 3.2.2 qRT-PCR39-40
• 3.2.3 数据分析40-41
• 4、miR-30a靶向作用于EYA2 mRNA3’UTR41-43
• 4.1 EYA2-3’UTR-wild type及-mutant序列的设计与合成41
• 4.2 载体构建及测序41-43
• 4.3 数据分析43
• 5、miR-30a水平和EYA2表达的相关性分析43-45
• 6、miR-30a mimics或EYA2 siRNAs能抑制A549细胞的迁移能力45-46
• 7、miR-30a mimics对A549细胞的周期进程没有影响46
• 8、miR-30a mimics对A549细胞的增殖没有影响46-48
• 9、miR-30a mimics或EYA2 siRNAs能抑制A549细胞的侵袭能力48-49
• 10、miR-124、miR-155、miR-140不能靶向调控A549细胞中EYA2的表达49-50
• 第4章 讨论50-54
• 参考文献54-63
• 致谢63

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 茹松伟;申卫红;杨鹏程;赵屹;邵启祥;;microRNA靶基因预测算法研究概况及发展趋势[J];生命科学;2007年05期

2 景花;宋沁馨;周国华;;MicroRNA定量检测方法的研究进展[J];遗传;2010年01期

，

本文编号：816655