NK4增强肝癌细胞Li-7对5-FU的敏感性及其作用机制的研究

发布时间：2017-09-08 22:38

  本文关键词：NK4增强肝癌细胞Li-7对5-FU的敏感性及其作用机制的研究

  更多相关文章： NK4 肝癌细胞 5-FU LY294002 药物耐受

【摘要】：目的:探索HGF对肝癌细胞Li-7增殖能力、5-FU敏感性的影响。尝试利用HGF拮抗剂-NK4增强Li-7细胞在HGF存在的情况下对5-FU的敏感性,并与PI3K靶向型抑制剂LY294002比较增敏效果,同时探索NK4影响Li-7对药物敏感性可能的分子机制。方法:1.提取并纯化质粒pc DNA3.1-NK4、pc DNA3.1。脂质体包裹实验检测脂质体与质粒最优转染比例。2.将pc DNA3.1-NK4和pc DNA3.1分别转染至Li-7细胞中,逆转录PCR鉴定NK4表达水平。3.MTT法检测不同浓度HGF对Li-7细胞增殖的影响,验证Li-7对5-FU的敏感性是否会受到HGF的影响。4.倒置显微镜下观察HGF对Li-7形态的影响。5.MTT法分别检测:在HGF、5-FU的干预下,未转染组、空质粒转染组、NK4转染组的Li-7细胞存活率的差异;LY294002是否可以逆转HGF诱导Li-7产生的5-FU耐受;LY294002对5-FU抑制HL7702、Li-7、SW480、Hep G2增殖的影响;LY294002对多种浓度的5-FU抑制Li-7增殖的影响;LY294002、PD98059、5-FU对Li-7增殖的影响。6.流式细胞术检测NK4、HGF、LY294002对5-FU诱导Li-7凋亡的影响。7.Western blot检测各组细胞中Akt、p-Akt、Bcl-2等蛋白的表达差异。结果:1.在不同浓度(0,0.2,2,20ng/ml)HGF的刺激下肝癌细胞Li-7的存活率没有发生显著变化(P0.05),但是当HGF浓度达到20ng/ml时能够显著降低5-FU诱导的增殖抑制(P0.01)。2.在HGF的刺激下,Li-7细胞形态由不规则形变为狭长形,细胞边缘变得更加清晰,且随HGF浓度升高形态变化越来越明显。3.将质粒pc DNA3.1-NK4、pc DNA3.1分别转染至Li-7细胞中,RT-PCR鉴定结果为NK4表达成功。4.在HGF(20ng/ml)与不同浓度的5-FU(0,12.5,25,50μg/ml)的干预下,转染pc DNA3.1-NK4的Li-7细胞与转染pc DNA3.1的细胞相比细胞存活率都明显降低(P0.05)。5.流式细胞术结果显示在接受相同浓度的HGF(20ng/ml)与5-FU(50μg/ml)处理后,转染pc DNA3.1-NK4的Li-7细胞的凋亡率明显低于转染pc DNA3.1的细胞(P0.05)。6.Western blotting结果显示NK4可以抑制HGF(20ng/ml)诱导的Akt的磷酸化,降低Bcl-2的表达(P0.05)。7.LY294002(10μg/ml)并没有促进5-FU(50μg/ml)对Li-7细胞的杀伤,反而在不同浓度(0.2,2,20ng/ml)HGF干预下,细胞存活率分别提升13.1%、19.7%、7.7%(P0.05)。8.与单独使用5-FU相比,LY294002(10μg/ml)、5-FU(50μg/ml)共同处理可以显著降低SW480、Hep G2细胞的存活率(P0.01、P0.05);恰恰相反的是,与单独使用5-FU相比,LY294002、5-FU共同处理提高了Li-7存活率(P0.05);单独使用5-FU处理或LY294002、5-FU共同处理HL7702细胞,细胞存活率并没有明显的差异(P0.05)。9.LY294002在5-FU浓度较低(5μg/ml)时,降低了Li-7细胞的存活率(P0.01);在5-FU浓度逐渐升高(达到50μg/ml)后,LY294002又提高了细胞存活率(P0.01)。10.LY294002(10μg/ml)、PD98059(20μg/ml)、5-FU(50μg/ml)共同处理Li-7细胞与LY294002、5-FU处理细胞相比,细胞存活率没有明显差异(P0.05)。11.流式细胞术结果显示,LY294002(10μg/ml)、5-FU(50μg/ml)共同处理与5-FU(50μg/ml)单独处理Li-7细胞相比细胞凋亡率明显下降(P0.05)。12.Western blotting结果显示LY294002处理Li-7后,细胞中Akt的磷酸化程度、Bcl-2的表达量明显降低(P0.05)。结论:1.NK4能够抑制HGF对Li-7细胞的刺激,增强5-FU对Li-7的增殖抑制作用,提高凋亡率。2.产生这种抑制效果的原因可能是NK4抑制了HGF诱导的Akt的磷酸化,降低了Bcl-2的表达。3.进一步证实了在5-FU对Li-7的细胞毒性作用较强时,虽然LY294002能够阻断PI3K/Akt信号通路,降低Bcl-2的表达,但是它提高了细胞存活率、降低了凋亡率,而这种作用不是通过激活Raf/Erk信号通路实现的。4.本文证实了NK4可以增强Li-7对5-FU的敏感性,为NK4治疗肝癌奠定一定的实验基础。探索了NK4增强化疗敏感性可能的分子机制,为NK4应用于肿瘤治疗提供理论依据。
【关键词】：NK4 肝癌细胞 5-FU LY294002 药物耐受
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 常用缩写词中英文对照表12-14
• 前言14-16
• 第一部分 HGF、NK4 对LI-7 细胞 5-FU耐受性的影响16-38
• 1 材料与方法16-29
• 1.1 材料16-20
• 1.2 方法20-29
• 2 结果29-35
• 2.1 HGF对Li-7 增殖的影响29
• 2.2 HGF对Li-7 形态的影响29-30
• 2.3 HGF诱导Li-7 对 5-FU产生耐受30-31
• 2.4 质粒DNA与脂质体最优混合比的确定31-32
• 2.5 逆转录PCR鉴定NK4 表达水平32
• 2.6 NK4 逆转HGF诱导的 5-FU耐受32-33
• 2.7 NK4 增强 5-FU诱导Li-7 细胞凋亡33-34
• 2.8 NK4 降低了Akt的磷酸化水平与Bcl-2 的表达量34-35
• 3 讨论35-37
• 4 结论37-38
• 第二部分NK4 逆转LI-7 对 5-FU耐受机制的研究38-49
• 1 材料与方法38-40
• 1.1 材料38
• 1.2 方法38-40
• 2 结果40-45
• 2.1 LY294002 减弱了 5-FU对Li-7 细胞的增殖抑制作用40
• 2.2 LY294002 联合 5-FU对Li-7、HL7702、SW480、HepG2 等细胞增殖的影响40-41
• 2.3 不同浓度的 5-FU联合LY294002 对Li-7 增殖的影响41-42
• 2.4 LY294002、PD98059、5-FU对Li-7 细胞增殖的影响42-43
• 2.5 LY294002 降低了 5-FU诱导的Li-7 细胞凋亡43
• 2.6 LY294002 降低了Akt的磷酸化水平与Bcl-2 的表达量43-45
• 3 讨论45-48
• 4 结论48-49
• 参考文献49-53
• 综述53-61
• 参考文献58-61
• 致谢61-62
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果62-63
• 个人简介63

【共引文献】

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本文编号：816740