抗人CCR4重组免疫毒素的表达与生物学功能研究

发布时间：2017-09-09 01:16

  本文关键词：抗人CCR4重组免疫毒素的表达与生物学功能研究

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【摘要】：目的：研究酵母菌表达抗人CCR4 (Anti-hCCR4)免疫毒素蛋白,研究其生物学活性。方法：运用巴斯德毕赤酵母Pichia Pastoris表达免疫毒素蛋白,经镍柱和离子柱纯化蛋白。用SDS-PAGE和Western Blot鉴定蛋白,用BCA法测定蛋白浓度。纯化的蛋白用NHS-Sulfo生物素标记技术,用流式细胞技术检测其对CCR4阳性细胞的特异性粘附作用。用3H标记的蛋白合成抑制试验和细胞增殖抑制试验检测免疫毒素对靶细胞的毒性作用。用流式细胞仪检测免疫毒素蛋白对人外周血淋巴细胞中CCR4阳性细胞特异性杀灭作用。最后用免疫缺陷小鼠(NSG)尾静脉注射肿瘤细胞,构建肿瘤模型,检测免疫毒素在小鼠体内的生物学活性。结果：经过表达和纯化得到了单价Anti-hCCR4免疫毒素蛋白(70.26kDa),双价Anti-hCCR4免疫毒素蛋白(97.57 kDa)和Foldback Diabody Anti-hCCR4免疫毒素蛋白(96.31kDa)。Anti-hCCR4免疫毒素均可特异性粘附CCR4阳性肿瘤细胞和人外周血淋巴细胞中CCR4阳性细胞群;该免疫毒素可以特异性抑制CCR4+ CCRF-CEM肿瘤细胞蛋白合成和增殖,可以特异性杀灭外周血淋巴细胞中CCR4阳性细胞群;并且该免疫毒素对CCR4阴性细胞几乎没有粘附和杀伤作用。在小鼠肿瘤模型内,双价和Foldback Diabody免疫毒素在小鼠体内可大量杀伤肿瘤细胞,延长小鼠存活时间。结论：本研究中成功表达和纯化了三种Anti-hCCR4免疫毒素,通过实验证实该免疫毒素可特异性粘附和杀灭CCR4阳性细胞,其中双价和Foldback Diabody免疫毒素在小鼠体内有较强的生物学活性,为下一步临床应用奠定了基础。
【关键词】：酵母表达 CCR4 免疫毒素 流式细胞技术 肿瘤治疗 小鼠模型
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.5
【目录】：

• 摘要7-8
• 文献综述8-14
• 1 免疫毒素概述8-10
• 1.1 免疫毒素简介8-9
• 1.2 免疫毒素及白喉毒素抗癌症研究进展9-10
• 2 CCR4简介10-11
• 3 调节性T细胞在肿瘤治疗中研究进展11-12
• 4 本实验设想12-14
• 前言14-15
• 试验材料及仪器15-20
• 1 试验材料15-18
• 1.1 试验动物15
• 1.2 细胞系15
• 1.3 主要药品和试剂15-16
• 1.4 试剂溶液的配制16-18
• 2 试验仪器18-19
• 3 数据分析及处理软件19-20
• 试验方法20-31
• 1 Anti-hCCR4免疫毒素的制备20-23
• 1.1 单价Anti-hCCR4免疫毒素蛋白表达20-21
• 1.2 蛋白纯化21-22
• 1.3 蛋白浓度测定22
• 1.4 双价Anti-hCCR4免疫毒素蛋白表达和纯化22-23
• 1.5 Foldback Diabody Anti-hCCR4免疫毒素表达和纯化23
• 2 Anti-hCCR4免疫毒素体外功能试验23-27
• 2.1 Anti-hCCR4免疫毒素对CCRF-CEM肿瘤细胞体外蛋白合成抑制试验23-24
• 2.2 Anti-hCCR4免疫毒素对CCRF-CEM肿瘤细胞体外增殖抑制试验24
• 2.3 Anti-hCCR4免疫毒素对CCRF-CEM表面抗原CCR4的特异性粘附试验24-25
• 2.4 Anti-hCCR4免疫毒素对人外周血淋巴细胞CCR4阳性细胞特异性粘附试验25-26
• 2.5 Anti-hCCR4免疫毒素对人外周血淋巴细胞CCR4阳性细胞群特异性杀伤试验26
• 2.6 Anti-hCCR4免疫毒素对人外周血淋巴细胞中调节性T细胞特异性粘附试验26-27
• 3 Anti-hCCR4免疫毒素对CCR4阴性细胞生物学功能试验27-29
• 3.1 Anti-CCR4免疫毒素对CCR4阴性肿瘤细胞的粘附作用27
• 3.2 Anti-CCR4免疫毒素对CCR4阴性肿瘤细胞的杀伤作用27-28
• 3.3 Anti-hCCR4免疫毒素对外周血淋巴细胞CCR4阴性细胞群杀伤试验28-29
• 4 Anti-hCCR4免疫毒素体内功能试验29-31
• 4.1 NSG小鼠CCRF-CEM肿瘤模型的诱导29-30
• 4.2 Anti-hCCR4免疫毒素对小鼠体内CCR4~+CCRF-CEM肿瘤细胞的杀灭作用试验30-31
• 试验结果31-49
• 1 Anti-hCCR4免疫毒素蛋白的表达31-33
• 1.1 Anti-hCCR4免疫毒素蛋白SDS-PAGE鉴定31
• 1.2 Anti-hCCR4免疫毒素蛋白Western Blot鉴定31-33
• 2 Anti-hCCR4免疫毒素生物学活性33-42
• 2.1 Anti-hCCR4免疫毒素对CCRF-CEM肿瘤细胞特异性粘附试验33-35
• 2.2 Anti-hCCR4免疫毒素对CCRF-CEM肿瘤细胞体外蛋白合成抑制试验35-38
• 2.3 Anti-hCCR4免疫毒素对CCRF-CEM肿瘤细胞体外增殖抑制试验38-40
• 2.4 Anti-hCCR4免疫毒素对人外周血淋巴细胞特异性粘附试验40
• 2.5 Anti-hCCR4免疫毒素对人外周血淋巴细胞CCR4阳性细胞群特异性杀伤作用40-41
• 2.6 Anti-hCCR4免疫毒素对调节性T淋巴细胞特异性粘附试验41-42
• 3 Anti-hCCR4免疫毒素对CCR4阴性细胞的生物学活性42-46
• 3.1 Anti-CCR4免疫毒素对CCR4阴性肿瘤细胞粘附作用42-44
• 3.2 Anti-CCR4免疫毒素对CCR4阴性肿瘤细胞杀伤作用44-45
• 3.3 Anti-hCCR4免疫毒素对外周血淋巴细胞CCR4阴性细胞群杀伤试验45-46
• 4 Anti-hCCR4免疫毒素体内试验46-49
• 4.1 小鼠CCRF-CEM肿瘤模型建立46
• 4.2 Anti-hCCR4免疫毒素对鼠体内CCR4~+CCRF-CEM肿瘤细胞的杀灭作用试验46-49
• 分析和讨论49-54
• 1 免疫毒素的构建,表达与纯化49
• 2 Anti-hCCR4免疫毒素生物学活性49-51
• 2.1 Anti-hCCR4免疫毒素对CCR4~+CCRF-CEM肿瘤细胞粘附作用49-50
• 2.2 Anti-hCCR4免疫毒素CCRF-CEM肿瘤细胞体外蛋白合成抑制作用50
• 2.3 Anti-hCCR4免疫毒素对CCRF-CEM肿瘤细胞体外增殖抑制作用50-51
• 2.4 Anti-hCCR4免疫毒素对人外周血淋巴细胞特异性粘附作用51
• 2.5 Anti-hCCR4免疫毒素对人外周血淋巴细胞杀伤作用51
• 2.6 Anti-hCCR4免疫毒素对调节性T淋巴细胞特异性粘附作用51
• 3 Anti-hCCR4免疫毒素对CCR4阴性细胞的生物学活性51-52
• 3.1 Anti-CCR4免疫毒素对CCR4阴性肿瘤细胞粘附作用52
• 3.2 Anti-CCR4免疫毒素对CCR4阴性肿瘤细胞杀伤作用52
• 3.3 Anti-hCCR4免疫毒素对外周血淋巴细胞CCR4阴性细胞群杀伤试验52
• 4 Anti-hCCR4免疫毒素小鼠体内生物学活性52-54
• 4.1 小鼠CCRF-CEM肿瘤模型建立52-53
• 4.2 Anti-hCCR4免疫毒素对小鼠体内CCR4~+CCRF-CEM肿瘤细胞的杀灭作用试验53-54
• 全文结论54-55
• 参考文献55-59
• Abstract59-61
• 致谢61

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 熊玉宁,王健伟;免疫毒素治疗恶性血液病[J];国外医学.输血及血液学分册;2000年05期

2 李俊植;免疫毒素研究及临床应用进展 (二)临床研究[J];中国生物制品学杂志;2004年02期

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本文编号：817436