不依赖CAR的肾癌组织特异性复制缺陷型重组腺病毒的构建及鉴定

发布时间：2017-09-09 06:18

  本文关键词：不依赖CAR的肾癌组织特异性复制缺陷型重组腺病毒的构建及鉴定

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【摘要】：目的:构建携带肾癌特异性启动子碳酸酐酶IX(Carbonic Anhydrase IX,CAIX)和人源化绿色荧光蛋白(humanized renilla reniformis Green Fluorescent Protein,hrGFP-1)报告基因的不依赖CAR的复制缺陷型5型重组腺病毒Ad5/f11-CAIX-E1A-hr GFP-1,建立检测肾癌患者外周血中循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)的新方法,为临床治疗提供理论依据。方法:分别双酶切pShuttle-CMV-hrGFP-1、pShuttle-CAIX-E1A获得hrGFP-1目的基因片段和载体基因片段,T4 DNA连接酶过夜连接,构建重组穿梭质粒pShuttle-CAIX-E1A-hr GFP-1,摇菌并提取质粒。质粒经PCR鉴定,鉴定证实构建正确的质粒经PmeI酶切线性化,与骨架质粒AdEasy-1/f11p依次转化入感受态BJ5183细菌,通过同源重组技术构建重组腺病毒质粒pAd5/f11-CAIX-E1A-hr GFP-1。将经PCR、酶切鉴定证实构建正确的重组腺病毒质粒,转化入感受态DH5a细菌扩增、保存。阳性质粒经PacI酶切后,转染HEK293细胞,获得重组腺病毒Ad5/f11-CAIX-E1A-hr GFP-1,经4轮扩增后纯化病毒,检测其滴度。结果:经PCR、酶切鉴定,证实重组穿梭质粒pShuttle-CAIX-E1A-hrGFP-1、重组腺病毒质粒pAd5/f11-CAIX-E1A-hrGFP-1构建正确;经4轮扩增后纯化,测定重组腺病毒的滴度为2.36×109pfu/ml。结论:不依赖CAR的肾癌组织特异性复制缺陷型重组腺病毒Ad5/f11-CAIX-E1A-hr GFP-1构建成功,为检测肾癌患者外周血中循环肿瘤细胞提供新的方法,对早期发现肾癌的恶性侵袭、判断肾癌分期、预后、指导个体化治疗及疗效评价等具有重要意义。
【关键词】：肾癌 循环肿瘤细胞 碳酸酐酶IX启动子 人源化绿色荧光蛋白 柯萨奇受体 重组腺病毒
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.11
【目录】：

• 中文摘要3-4
• Abstract4-6
• 英文缩写索引6-9
• 前言9-12
• 材料和方法12-19
• 1.1 实验材料12-15
• 1.1.1 质粒、菌株及细胞12-13
• 1.1.2 主要实验试剂13
• 1.1.3 实验设备及仪器13-14
• 1.1.4 主要溶液及配制14-15
• 1.2 实验方法15-19
• 1.2.1 重组穿梭质粒pShuttle-CAIX-E1A-hrGFP-1 的构建及鉴定15-17
• 1.2.2 重组腺病毒质粒的构建及鉴定17-18
• 1.2.3 重组腺病毒包装及扩增18-19
• 结果19-22
• 2.1 重组穿梭质粒鉴定19-20
• 2.1.1 重组穿梭质粒pShuttle-CAIX-E1A-hrGFP-1 的PCR鉴定19-20
• 2.2 重组腺病毒质粒鉴定20-21
• 2.2.1 重组腺病毒质粒pAd5/f11-CAIX-E1A-hrGFP-1 的PCR鉴定20-21
• 2.2.2 重组腺病毒质粒pAd5/f11-CAIX-E1A-hrGFP-1 的酶切鉴定21
• 2.3 重组腺病毒的包装、扩增、提纯及滴度测定21-22
• 讨论22-27
• 结论27-28
• 参考文献28-34
• 综述34-41
• 参考文献38-41
• 研究生期间的发表论文及参与课题41-42
• 致谢42

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本文编号：818783