HER2单链抗体可变区表达与纯化及抑制肿瘤细胞T6-17增殖的实验研究
发布时间:2017-09-09 13:55
本文关键词:HER2单链抗体可变区表达与纯化及抑制肿瘤细胞T6-17增殖的实验研究
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【摘要】:目的:构建HER2-sc Fv表达载体,体外纯化获得HER2-sc Fv蛋白,进而探讨HER2-sc Fv抑制高表达HER2的肿瘤细胞系T6-17增殖,为下一步抗肿瘤研究奠定实验基础。方法:①根据已有质粒p UC57-HER2-sc Fv为模板设计引物,采用PCR技术获取目的基因HER2-sc Fv。②运用双酶切及分子克隆等技术将目的基因片段克隆入原核表达质粒p ET28a,构建p ET28a-HER2-sc Fv重组质粒。③重组质粒p ET28a-HER2-sc Fv转化Rosetta大肠杆菌,利用IPTG诱导表达获得HER2-sc Fv蛋白。④蛋白亲和层析方法纯化蛋白,进而对包涵体蛋白复性。⑤SDS-PAGE及Western blot证实IPTG诱导HER2-sc Fv蛋白表达。⑥实验分为三组,分别为空白对照组,HER2-sc Fv组和曲妥珠单抗组。应用MTT法研究HER2-sc Fv对HER2阳性肿瘤细胞T6-17增殖的生长抑制作用。结果:①PCR技术成功获得HER2-sc Fv目的基因。②构建的原核表达质粒载体p ET28a-HER2-sc Fv,经鉴定证实插入序列方向大小正确,质粒构建成功。SDS-PAGE和Western blot证实IPTG诱导p ET28a-HER2-sc Fv转化的Rosetta大肠杆菌表达HER2-sc Fv蛋白成功,大小约为29KDa。获得包涵体蛋白并复性,浓度为1358.3mg/L,纯度约为90%,一升菌液可获得蛋白约10mg左右。③MTT实验检测三组结果显示:HER2-sc Fv组抑制HER2阳性肿瘤细胞T6-17的抑制率为33.52%,与PBS组比较差异有统计学意义(P=0.000,P0.05);曲妥珠单抗组抑制HER2阳性肿瘤细胞T6-17的抑制率为34.79%,与PBS组比较差异有统计学意义(P=0.000,P0.01);而HER2-sc Fv组与曲妥珠单抗组比较差异无统计学意义(P=0.429,P0.05)。结论:①成功构建重组质粒pET28a-HER2-sc Fv。②重组质粒转化Rosetta大肠杆菌后经IPTG诱导可高效稳定的表达HER2-sc Fv蛋白。③HER2-sc Fv蛋白在体外可以显著抑制HER2阳性肿瘤细胞T6-17的增殖,该蛋白可进一步应用于体内实验研究。
【关键词】:HER2 单链抗体 蛋白纯化 T6-17细胞系
【学位授予单位】:天津医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R730.2
【目录】:
- 中文摘要4-5
- Abstract5-8
- 缩略语/符号说明8-10
- 前言10-13
- 研究现状、成果10-12
- 研究目的、方法12-13
- 实验技术路线图13-14
- 对象和方法14-34
- 1.实验对象14-21
- 2.实验方法21-33
- 3.统计学方法33-34
- 结果34-43
- 讨论43-50
- 结论50-51
- 参考文献51-57
- 发表论文和参加科研情况说明57-58
- 综述 以HER2为靶点的靶向治疗研究与进展58-69
- 综述参考文献64-69
- 致谢69
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 夏启玉;肖苏生;邓柳红;易小平;张春发;;包涵体蛋白的复性研究进展[J];安徽农业科学;2008年14期
,本文编号:820834
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