KRAB型锌指蛋白PITA和PISA转基因小鼠表型分析及SUMO化修饰的Apak对核糖体RNA合成调控的研究

发布时间：2017-09-10 16:19

  本文关键词：KRAB型锌指蛋白PITA和PISA转基因小鼠表型分析及SUMO化修饰的Apak对核糖体RNA合成调控的研究

  更多相关文章： 细胞代谢 p53 KRAB 型锌指蛋白 糖酵解 线粒体氧化磷酸化 Apak SUMO 化修饰 核糖体 RNA

【摘要】：p53作为重要的转录因子,响应多种细胞信号的应激,从而调控下游不同的靶基因维持细胞的稳定。以往的研究主要关注p53对细胞周期阻滞和凋亡的调控,近年来p53相关代谢的靶基因的研究成为热点,研究表明p53可以通过转录激活下游靶基因TIGAR和SCO2的表达抑制糖酵解,促进氧化磷酸化。随着对p53参与代谢调控研究的深入,p53的上游分子如何参与代谢靶基因的选择性调控,从而最终决定细胞的命运成为研究的新方向。在哺乳动物中KRAB型锌指蛋白分子(KZNF)组成了最大的转录调控因子家族,大量的研究发现KZNF蛋白表现出转录抑制效应,参与细胞的增殖、凋亡及代谢等调控过程。Apak(ATM and p53 associated KZNF protein)是实验室前期在该家族中鉴定到新的p53负调控因子,能够选择性调控p53相关的凋亡靶基因的表达,而对细胞周期阻滞没有明显影响。KZNF家族分子功能结构域比较保守,那么该家族是否还有其它分子参与p53介导的代谢相关靶基因的选择性调控,目前尚无报道。分子实验研究发现,KZNF蛋白家族中两个分子KZNF475和KZNF568能够抑制p53的转录活性,且能够与p53结合;KZNF475特异性抑制p53下游靶基因TIGAR的表达,因此将其命名为PITA(p53 inhibitor on TIGAR activation),KZNF568特异性抑制p53下游靶基因SCO2的表达,因此将其命名为PISA(p53inhibitor on SCO2 activation)。TIGAR抑制糖酵解中的限速酶磷酸果糖激酶1(PFK1)的活性抑制糖酵解并促进磷酸戊糖旁路途经;SCO2促进细胞色素c氧化酶复合体的组装并对酶活性有重要的调控作用。在细胞学水平检测发现PITA选择性的抑制TIGAR的表达,促进细胞糖酵解进程;PISA选择性的抑制p53对SCO2的转录激活,从而抑制氧化磷酸化。p53感应不同程度的应激从而做出相应的细胞学反应,当在轻微的损伤应激下PITA解除了对p53的抑制,促进细胞的修复存活。在严重损伤应激下,PISA与p53发生解离,使得p53下游的SCO2被激活,诱发细胞的死亡。本研究首先成功构建了PITA、PISA转基因小鼠模型,并利用该模型从动物体内水平进一步验证PITA与PISA对糖酵解通路及线粒体氧化磷酸化通路的调控。研究发现PITA转基因小鼠骨骼肌组织中PFK1的活性较野生型小鼠明显升高,葡萄糖的消耗以及乳酸的生成增加,表明小鼠体内糖酵解速率增强;进一步检测发现PITA转基因小鼠体内NADPH的水平降低,表明小鼠体内还原力降低;PITA转基因小鼠整体代谢水平低于野生型小鼠。与野生型小鼠比较发现PISA转基因小鼠骨骼肌组织和肾脏中细胞色素C氧化酶活性降低,能量的代谢倾向于通过糖酵解途经;PISA转基因小鼠的整体代谢水平低于野生型小鼠。当p53缺失时,ATP的产生的主要方式转变为糖酵解而非正常的氧化磷酸化途经,这一现象在肿瘤细胞中称为Warburg效应。对能量代谢的调控是p53发挥抑制肿瘤的重要功能。通过多器官癌的筛选发现,PITA、PISA在食管癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌和肺癌中都有较高的表达,其中结直肠组织的癌和癌旁表达差异最为明显,通过75例结直肠癌临床样本分析表明PITA、PISA的表达癌高于癌旁,具有显著性差异。综上,本研究首次建立PITA和PISA转基因小鼠模型,获得了关于PITA和PISA基因生理功能的证据,发现了PITA和PISA分别在糖酵解通路和线粒体氧化磷酸化通路中发挥重要的选择性调控功能,并且初步探讨了PITA和PISA与结直肠癌的相关性。核糖体是由核糖体RNA和核糖体蛋白组成的复合体,其功能是参与蛋白质合成。SUMO化修饰对底物蛋白的定位及活性有重要的调控作用,前期研究发现在核仁应激下ARF促进Apak发生SUMO化修饰并使其入核仁。为了进一步探讨SUMO化修饰的KRAB型锌指蛋白Apak对核糖体RNA合成的调控功能,本研究通过Northern Blot检测SUMO化修饰的Apak对核糖体RNA合成的影响;通过运用实时定量PCR检测SUMO化修饰的Apak对核糖体RNA转录水平的调控;采用RNA-Ch IP方法检测核糖体RNA与Apak蛋白的相互作用,结果表明:SUMO化修饰的Apak抑制47S核糖体RNA前体的合成,主要抑制RNA聚合酶Ⅰ介导转录的18S和5.8S r RNA,另外在放线菌素D以及原癌基因Ras V12激活条件诱导下促进Apak与18S、5.8S核糖体RNA相互作用。本次研究为理解Apak的功能和作用机制提供了新的依据,为深入研究KRAB型锌指蛋白家族分子功能奠定了基础。
【关键词】：细胞代谢 p53 KRAB 型锌指蛋白 糖酵解 线粒体氧化磷酸化 Apak SUMO 化修饰 核糖体 RNA
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.2
【目录】：

• 缩略语5-6
• 第一部分KRAB型锌指蛋白PITA和PISA转基因小鼠表型分析6-38
• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-15
• 实验材料15-18
• 实验方法18-24
• 实验结果24-35
• 讨论35-38
• 第二部分SUMO化修饰的Apak对核糖体RNA合成的调控作用38-46
• 中文摘要38-39
• Abstract39-40
• 前言40
• 实验材料40-41
• 实验方法41-42
• 实验结果42-46
• 讨论46
• 结论46-47
• 参考文献47-55
• 附录55-56
• 致谢56-58
• 综述58-70
• 参考文献64-70

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本文编号：825334