DKK1对非小细胞肺癌增殖和转移影响的研究

发布时间：2017-09-11 08:24

  本文关键词：DKK1对非小细胞肺癌增殖和转移影响的研究

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【摘要】：研究背景与目的作为全球常见的恶性肿瘤之一,肺癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势。从病理组织类型上可以将肺癌分为非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(Small cell lung cancer,SCLC),非小细胞肺癌又可以分为腺癌、鳞癌、大细胞癌等多种亚型,约80%的肺癌病例为NSCLC。NSCLC的高死亡率与其易发生转移的特性密切相关,其中超过一半的病例在确诊时已经发生了转移。因此,深入探索NSCLC的增殖和转移能力及其相关分子机制,对临床早期诊断以及病情的监控和治疗等都具有积极的作用。随着研究的深入,众多影响肺癌发生和发展的因素成为关注的重点,Dickkopf-1(DKK1)就是其中之一。在脊椎动物中DKK基因家族包括DKKl、DKK2、DKK3及DKK4四个成员,都属于外分泌型的糖蛋白,DKK1作为Wnt信号通路的拮抗分子,一直都受到广泛的关注。相关研究发现,DKK1在不同肿瘤中的表达量及其生物学功能有很大差异:一方面能够抑制结肠癌和绒毛膜癌细胞的侵袭和迁移能力;另一方面却能够促进食管癌细胞的增殖和侵袭能力。已有研究证实DKK1在多种癌症的发生、发展中发挥重要的作用,但它在肺癌中的作用及其机制却不甚明了。本课题旨在研究DKK1对肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力的影响,继而分析其作用机制,探讨DKK1对肺癌诊断、预防及治疗的价值。方法应用Western-blot方法检测H1299、A549、95C、801D四种NSCLC细胞系中DKK1蛋白的表达水平。使用DKK1 shRNA重组慢病毒载体感染H1299、95C细胞系,来建立DKK1低表达的细胞模型H1299-DKK1-KD、95C-DKK1-KD。以无意义序列重组慢病毒载体感染的H1299、95C细胞系作为阴性对照H1299-NC、95C-NC,正常H1299、95C细胞系作为空白对照。通过Western-blot检测已构建的细胞模型中DKK1的表达,验证构建效果。细胞增殖实验,单克隆集落形成实验验证DKK1对nsclc细胞增殖能力的影响。通过transwell实验观察dkk1对nsclc细胞迁移和侵袭能力的影响。采用western-blot检测构建成功的细胞模型中增殖相关蛋白β-链蛋白(β-catenin)、细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellularregulatedproteinkinases1/2,erk1/2)、p-erk1/2及emt相关蛋白snail等蛋白的表达水平,探讨dkk1对nsclc细胞增殖、侵袭及迁移能力影响的分子机制。结果1.western-blot结果表明,dkk1蛋白在h1299、95c中表达水平较高,在a549、801d中表达较低。2.利用荧光显微镜观察,经重组慢病毒感染的h1299、95c细胞中gfp阳性率大于85%,且western-blot结果显示dkk1在两种细胞中蛋白表达水平较空白对照组显著下降。经无义序列重组慢病毒载体感染的两种细胞系中dkk1的表达量与空白对照相比无变化。证明已成功构建了dkk1低表达的h1299-dkk1-kd、95c-dkk1-kd细胞模型及阴性对照h1299-nc、95c-nc细胞模型。3.利用高内涵分析平台研究下调dkk1表达对h1299细胞增殖能力的影响。h1299-dkk1-kd组相比较于h1299及h1299-nc组细胞增殖能力明显减低。单克隆集落形成实验结果显示,h1299-dkk1-kd组集落数相对于h1299、h1299-nc两组下降60%,接触受到抑制。这些结果提示下调dkk1可显著抑制h1299细胞的增殖能力。4.不铺胶transwell实验结果显示,h1299-dkk1-kd和95c-dkk1-kd组每视野过膜细胞数为45.00±8.72和104.67±6.02,远远低于阴性对照组h1299-nc(148.00±13.75)、9c-nc(235.67±28.68)和空白对照组h1299(147.67±9.07)、95c(235.00±23.06),提示下调dkk1的表达水平可抑制nsclc细胞的迁移能力。铺胶transwell实验结果显示,h1299-dkk1-kd和95c-dkk1-kd组每视野过膜细胞数为46.33±11.50和71.33±6.81,低于空白对照组h1299(255.33±13.58)、95c(293.00±13.07)和阴性对照组h1299-nc(258.00±19.00)、9c-nc(302.67±23.16),结果提示下调dkk1的表达水平能够抑制nsclc细胞的侵袭能力。5.Western-blot结果显示,磷酸化的Erk1/2蛋白在H1299-DKK1-KD组中的表达水平明显低于对照组,H1299-DKK1-KD组中磷酸化的β-catenin表达水平较对照组明显升高,提示DKK1对NSCLC细胞增殖能力的影响可能是通过活化Erk1/2、β-catenin来实现的。EMT相关蛋白snail在H1299-DKK1-KD的表达水平明显低于对照组,提示DKK1对NSCLC细胞迁移及侵袭能力的影响可能是通过调控EMT相关蛋白snail来实现的。结论1.DKK1在四种NSCLC细胞系H1299、A549、95C和801D中的表达水平不同。2.DKK1可以促进NSCLC细胞的增殖能力,这种作用可能是通过活化MAPK信号通路中的关键蛋白Erk1/2,或者Wnt信号通路中的下游作用元件β-catenin来实现的。3.DKK1可能通过调节EMT相关蛋白snail来影响NSCLC细胞的迁移、侵袭能力。
【关键词】：DKK1 非小细胞肺癌 β-链蛋白
【学位授予单位】：北京市结核病胸部肿瘤研究所
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 缩略词表5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-17
• 材料与方法17-29
• 实验结果29-40
• 讨论40-46
• 结论46-47
• 参考文献47-52
• 综述一52-65
• 参考文献60-65
• 综述二65-74
• 参考文献71-74
• 攻读学位期间发表论文情况74-75
• 致谢75-76
• 个人简历76-77

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本文编号：829643