相关肿瘤标志性microRNA新型检测体系的构建及其应用

发布时间：2017-09-11 08:23

  本文关键词：相关肿瘤标志性microRNA新型检测体系的构建及其应用

  更多相关文章： 分子信标 肿瘤 miR-204 DSN Pre-miR-21

【摘要】：microRNA(miRNA)是一类内源性长约19-25nt(核苷酸)的非编码微小核糖核酸,它能在转录后水平上调控基因的表达。miRNA在生物体内普遍存在并参与调控许多生命过程,包括细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、个体发育、疾病发生、基因调控及代谢。miRNA的异常与人类肿瘤疾病相关,因而,在肿瘤疾病中定量检测miRNA能为肿瘤的诊断、治疗与预后提供依据。分子信标因特异性强、灵敏度高、操作简单快速等特点,成为最理想的定量检测miRNA的工具之一。本文主要致力于基于分子信标定量检测miRNA的研究,主要内容如下：1.分子信标直接检测肿瘤相关的miRNA-204本章利用以miRNA-204为靶标的分子信标,通过优化分子信标稳定性、杂交性能、特异性的条件,构建MB/miR-204杂交标准曲线,建立了一种快速、安全、特异的miRNA-204定量检测新方法,该方法检测线性范围在1-100nM,检测下限达到1nM。将其用于肿瘤细胞和胶质瘤组织中的miRNA-204表达变化定量检测,发现miRNA-204在MCF-7细胞和胶质瘤组织中下调,为深入阐明miRNA-204在肿瘤发生中的作用提供了可靠的实验依据。2.分子信标结合DSN介导的高灵敏miRNA-204检测本章利用DSN酶的特点,设计了DNA与RNA嵌合的分子信标,通过考察酶促介导信号放大体系的影响因子,优化了实验条件,建立了检测下限在pM级的高灵敏检测miRNA-204的方法。运用分子信标结合DSN的检测体系,定量检测肿瘤细胞和胶质瘤组织中miRNA-204的表达水平,结果发现与直接检测一致,表明该体系准确可靠。此方法为无创检测临床样品、研究miRNA功能、疾病的早期诊断与预后提供新的检验手段。3.分子信标检测肿瘤相关的Pre-miR-21本章我们通过优化MB/Pre-miR-21杂交的实验条件,考察MB的特异性,构建检测Pre-miR-21的标准曲线,建立了一种分子信标检测发夹结构的前体miRNA--Pre-miR-21的新方法。将其应用到检测MCF-7细胞、胶质瘤、胃癌中Pre-miR-21的表达水平,并以qRT-PCR验证其准确性。结果发现：MCF-7细胞中干扰Z38基因表达能使Pre-miR-21表达上调；胃癌癌组织比癌旁组织Pre-miR-21表达水平高；胶质瘤中恶性程度越高Pre-miR-21表达越高,呈正相关趋势。分子信标在Pre-miR-21检测中表现出良好的应用前景。
【关键词】：分子信标 肿瘤 miR-204 DSN Pre-miR-21
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.43
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 第1章 绪论10-26
• 1.1 本文的研究背景及意义10
• 1.2 microRNA概述10-19
• 1.2.1 miRNA的研究背景10-11
• 1.2.2 miRNA的特点11
• 1.2.3 miRNA的生物合成过程及作用机制11-12
• 1.2.4 miRNA与疾病12-13
• 1.2.5 miRNA的检测方法13-19
• 1.3 分子信标概述19-25
• 1.3.1 分子信标的基本原理19-20
• 1.3.2 影响分子信标性能的因素20-21
• 1.3.3 分子信标研究进展与应用21-25
• 1.4 本文拟开展的工作25-26
• 第2章 分子信标直接检测肿瘤相关的miR-20426-40
• 2.1 前言26-27
• 2.2 实验部分27-33
• 2.2.1 分子信标检测miRNA的实验原理27
• 2.2.2 仪器与试剂27-28
• 2.2.3 实验方法28-33
• 2.3 结果与讨论33-39
• 2.3.1 分子信标稳定性及杂交性能的影响因子33-34
• 2.3.2 分子信标与靶miRNA杂交特异性考察34-35
• 2.3.3 分子信标杂交标准曲线的构建35-36
• 2.3.4 肿瘤细胞/织总RNA的鉴定与浓度测定36
• 2.3.5 分子信标检测MCF-7细胞中miR-204表达水平36-37
• 2.3.6 qRT-RCR法检测MCF-7细胞中miR-204表达水平37-38
• 2.3.7 分子信标检测胶质瘤组织中miR-204表达水平38-39
• 2.3.8 qRT-RCR法检测胶质瘤组织中miR-204表达水平39
• 2.4 小结39-40
• 第3章 分子信标结合DSN介导的miR-204高灵敏检测40-48
• 3.1 前言40-41
• 3.2 实验部分41-43
• 3.2.1 DSN酶介导分子信标信号放大检测miRNA原理41
• 3.2.2 仪器和试剂41-42
• 3.2.3 实验方法42-43
• 3.3 结果与讨论43-47
• 3.3.1 分子信标抗酶切能力与酶促放大可行性分析43-44
• 3.3.2 DSN酶浓度条件的优化44
• 3.3.3 信号放大检测下限的确定与标准曲线构建44-45
• 3.3.4 分子信标酶促信号放大检测肿瘤细胞中miR-204表达水平45-46
• 3.3.5 分子信标酶促信号放大检测胶质瘤组织中miR-204表达水平46-47
• 3.4 小结47-48
• 第4章 分子信标直接检测肿瘤相关的Pre-miR-2148-62
• 4.1 前言48
• 4.2 实验部分48-54
• 4.2.1 分子信标直接检测Pre-miRNA的实验原理48-49
• 4.2.2 仪器与试剂49-50
• 4.2.3 实验方法50-54
• 4.3 结果与讨论54-61
• 4.3.1 分子信标热稳定性考察54-55
• 4.3.2 分子信标检测Pre-miR-21可行性分析55
• 4.3.3 分子信标/Pre-miR-21杂交实验条件的优化55-57
• 4.3.4 MB/Pre-miR-21杂交标准曲线的构建57-58
• 4.3.5 分子信标检测MCF-7细胞中PmiRNA-21表达水平58-59
• 4.3.6 qRT-RCR法检测MCF-7细胞中Pre-miR-21表达水平59
• 4.3.7 分子信标检测肿瘤组织中Pre-miR-21表达水平59-60
• 4.3.8 qRT-RCR法检测肿瘤组织中Pre-miR-21表达水平60
• 4.3.9 Western blotting检测Pre-miR-21调控的靶蛋白60-61
• 4.4 小结61-62
• 结论与展望62-63
• 参考文献63-71
• 附录 攻读硕士学位期间参与发表论文和专利71-72
• 致谢72

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