抑制KLF8的表达诱导细胞分化并提高结直肠癌对5-FU的敏感性

发布时间：2017-09-11 12:38

  本文关键词：抑制KLF8的表达诱导细胞分化并提高结直肠癌对5-FU的敏感性

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【摘要】：研究背景和目的KLF8是KLF转录因子家族中的一员,在肿瘤的发生中扮演着重要的角色。它在羧基端含有高度保守的锌指结构结合域,并与目标基因启动子CACCC区域结合。KLF8最初是作为p球蛋白基因表达的转录抑制因子而被认识,随后人们发现它在细胞增殖、肿瘤转化、上皮-间质转变、肿瘤侵袭和转移的调节中起着重要作用。由此推断,KLF8应该在众多组织中表达,但是实际情况是它在绝大多数正常细胞和组织中无法检测到,却在人类多种肿瘤中呈现过表达,包括乳腺癌、卵巢癌、肾癌、肝癌、胃癌和脑部肿瘤。因此,KLF8已经成为一个重要的肿瘤调节蛋白。然而,KLF8在结直肠癌中的表达和作用却未见报道。本研究拟通过检测KLF8在结直肠癌中的表达,进一步明确其在细胞分化中的作用,并探讨KLF8沉默表达对恶性肿瘤细胞增殖的抑制作用。材料和方法1.化学药品,组织标本和细胞系丁酸钠(NaB)和5-FU从Sigma(St. Louis, MO)购得,罗丹明毒蕈肽从Molecular Probes (Eugene, OR)购得。山羊抗人KLF8和GAPDH抗体从Aviva Systems Biology公司(San Diego, CA)购得。对于蛋白免疫印迹分析,14对结肠癌和邻近正常组织(肿瘤边缘5厘米)来自南方医院(广州,中国)外科手术切除的患者。所述组织标本一部分取下后迅速冷冻于液氮中,然后储存在-70-C冰箱直到使用时拿出。另一部分组织包埋于石蜡中,切片,然后用免疫组织化学进行的组织病理学检测,组织中阳性染色的癌细胞10%即视为阳性。结直肠癌细胞系(HCT1116, HT29, Lovo, SW620, SW480)和人胚肾293(HEK293)细胞系从ATCC (Rockville, MD)中获得,并在RPMI1640培养基中培养如先前所述。2.RNA分离和逆转录PCR分析使用TRI试剂(Sigma)分离总RNA[7],然后根据制造商的说明书使用SuperScript Ⅱ(Invitrogen, Carlsbad, CA)转录。引物的序列如下：癌胚抗原(CEA)上游引物：5'-AACCCTTCATCACCAGCAAC-3',CEA下游引物：5'-CAGGAGAGGCTGAGGTTCAC-3';E-cadherin上游引物： 5’-TGCCCAGAAAATGAAAAAGG-3',E-cadherin下游引物： 5’-GTGTATGTGGCAATGCGTTC-3';GAPDH上游引物： 5’-GTCAACGGATTTGGTCGTATTG-3',GAPDH下游引物： 5’-CTCCTGGAAGATGGTGATGGG-3'。CEA,E钙粘蛋白和GAPDH的PCR产物的预期片段大小分别为340,200和204bp。3.蛋白免疫印迹分析抽提细胞总蛋白裂解产物用于蛋白免疫印迹分析。印迹通过一抗与辣根过氧化物酶标记的二抗结合进行探测。抗原-抗体复合物通过使用增强的化学发光系统(Amersham Biosciences, UK)使其可视化。4.细胞锚定依赖性和锚定非依赖性生长检测阴性对照siRNA (src siRNA)和转染KLF8 siRNA的细胞一式三份接种在含有0.7%琼脂基质和0.35%琼脂上胶的平板[刀。菌落用考马斯蓝染色评分,含有至少50个细胞的克隆被认为是可行的。细胞增殖试剂WST-1,一个即用型比色测定法(Roche Diagnostics),也被使用。5.细胞凋亡检测根据产品使用说明(Trevigen Inc., Gaithersburg, MD)在细胞使用膜联蛋白V-FITC试剂盒,,通过流式细胞术使用Winmdi2.9流式分析软件进行凋亡检测[18]。我们也通过用Hoechst33258对细胞核进行染色,然后在荧光显微镜下观察进行凋亡检测。凋亡蛋白酶3、8、9的活性按照产品说明书(Clontech, Mountain View,CA)使用ApoAlert凋亡蛋白酶比色测定试剂盒来进行检测。6.免疫荧光纤维肌动蛋白染色，将细胞固定于盖玻片上并用若丹明共轭毒蕈肽(5 U/ml,Molecular Probes)在PBS中室温孵育。此外,细胞核用1μg/ml的Hoechst33258进行染色。最后洗涤、固定盖玻片,并使用Zeiss Axioskop荧光显微镜观察。7.体外转染siRNA本实验siRNA双链包含有21碱基对并有2个碱基脱氧核苷酸突出端(Proligo, Singapore)。在KLF8 siRNA (NM_007250,正义链：CGAUAUGGAUAAACUCAUATT)序列与先前的研究是一样的[19],src siRNA (5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'),不针对任何基因,被用作阴性对照。细胞siRNA双链体的转染用脂质体按照(Invitrogen)产品说明书来进行。8.构建和转染包含KLF8短发夹RNA的慢病毒载体为了进一步研究siRNA诱导下调KLF8在活体肿瘤生长中的作用,我们构建了KLF8-RNA干扰慢病毒载体(pGCSIL-KLF8shRNA)(上海吉凯基因技术有限公司),绿色荧光蛋白慢病毒载体(pGCSIL-GFP)用作阴性对照。双链寡核苷酸编码人KLF8-vshRNA (CCGGCTAGCATGCTACAAGCTCCA-ATTCAAGAGATTGGAGCTTGTAGCATGCTAGTTTTTG)被插入到短发夹RNA (shRNA)表达载体pGCSIL (Shanghai GeneChem Co, Ltd),克隆的身份通过测序进行验证。重组慢病毒载体通过共转染试验实现,即将慢病毒表达载体以及慢病毒包装质粒混合物用LipofectamineTM 2000按照产品说明书共转染HEK293T细胞。传染性的慢病毒颗粒在转染后48小时收集,然后通过0.45-μm乙酸纤维素滤器过滤。病毒浓缩和滴度通过在293T细胞中连续稀释确定。对于慢病毒转染,将Lovo细胞按照1×105个细胞/孔在6孔培养板进行传代培养,然后按照感染倍数(MOI)为50转染表达KLF8-siRNA或src-siRNA的慢病毒,在转染后72小时收获细胞,转染效率通过计数绿色荧光蛋白阳性细胞的百分比进行评估。9.异位移植瘤模型转染KLF8的抗肿瘤作用通过活体裸鼠异种移植模型进行评估。五到六周龄雌性BALB/c裸鼠在南方医科大学(中国广州)无菌饲养环境下饲养,所有动物研究均经过南方医科大学动物伦理委员会批准实施。感染src shRNA和KLF8shRNA'慢病毒的Lovo细胞在指数生长期收获,然后用无菌PBS将细胞进行两次洗涤,并以每毫升5x 107个细胞的密度重新悬浮于PBS中。接下来将细胞悬浮液(0.1 ml；5 x 106个细胞)注射到每只裸鼠的右背皮下。将感染src-shRNA慢病毒的Lovo细胞分别注射到a组和c组裸鼠。将感染KLF8-shRNA慢病毒的Lovo细胞分别注射到b组和d组裸鼠。皮下注射Lovo细胞十四天后,将5-FU用10-ml的微型注射器(Hamilton, Reno, NV, USA)通过腹腔内注射注入c组和d组,注射剂量为50μg/kg/次,每两天一次,共12次。每组5只裸鼠,肿瘤体积计算如下：V=(4/3)R12R2,其中R1代表短径1,R2代表长径2,并且R1R2。最后在第42天将小鼠处死,切下肿瘤,快速冷冻在液氮中并储存在-70-C冰箱,为行蛋白免疫印迹检测准备。统计分析采用SPSS13.0软件进行统计分析。体内及体外实验检测数据均采用均数±标准差(x±SD)表示,如果统计数据方差齐性,我们采用两组间独立样本t检验或多组间one way ANOVA进行统计分析。如果方差不齐,我们则使用Satterthwaite近似t检验或Dunnett's T3检验,P0.05为差异有显著性。结果1.结肠癌组织中KLF8蛋白表达水平高于正常组织我们首先发现在与人上皮细胞系HEK293细胞相比,五个癌症细胞系HCT1116、HT29、Lovo、SW620和SW480中KLF8蛋白表达显著增高(图1)。然后,我们通过蛋白免疫印迹检测了KLF8在正常组织(N)和对应的结肠癌组织(T)中的表达。在14对组织中,有10对癌组织的KLF8表达水平高于正常组织(图2)。我们还将从肠镜下采集的癌症和正常组织标本通过免疫组化方法来检测KLF8的表达。我们发现在所有收集的癌组织中KLF8蛋白特定表达在细胞核,但不表达在对照正常组织中,如图3(b)和(c)所示。图3显示KLF8在正常组织和癌组织标本中的表达。以上表明,KLF8在结直肠癌中是高表达的。2.ERK1／2组成性活化的抑制下调KLF8表达先前的研究已经表明,活化的MAPK/ERK信号通路参与结直肠癌[2,21]细胞增殖的调节。因此,我们通过加入一个特定的MEK/ERK信号通路活化抑制剂-U0126,在Lovo和SW620细胞孵育48小时后,观察分析了抑制ERK信号通路对KLF8表达的影响。我们发现,磷酸化ERK1/2和KLF8的表达在经过U0126处理后都以剂量和时间依赖性的方式显著下调(图4和图5)。另一方面,我们观察到敲低表达KLF8对ERK活化的影响。免疫印迹方法验证siRNA敲低表达效率后,发现磷酸化ERK1/2的表达在KLF8敲低表达后显著降低。然而,ERK1/2的表达没有变化(图6)。这些结果表明,在结直肠癌中抑制KLF8表达可能在ERK活化中起重要作用。3.肠癌细胞中压低KLF8表达诱导细胞分化为明确KLF8对细胞分化的作用,我们首先研究了促分化剂对KLF8表达圈的影响。丁酸钠作用于Lovo和SW620细胞,显著降低KLF8(图7)的表达。接下来,我们通过RT-PCR发现敲低KLF8表达显著增加分化标志CEA和E-cadherin23](图8)的表达。此外,使用鬼笔环肽染色观察细胞形态,以检测微丝肌动蛋白的定位,转染KLF8-siRNA的微丝肌动蛋白细胞质呈弥漫和大致均匀分布表现。然而,转染src-siRNA的人结肠癌细胞系表现明显聚集体,并在该凸部的边缘区域中有多个肌动蛋白聚合团块(图9)。因此,上述结果表明敲低KLF8表达可能诱导结直肠癌细胞的分化。4.敲低KLF8表达抑制细胞锚定依赖性和锚定非依赖性生长我们使用WST-1测定法评估了压低KLF8表达对结直肠癌细胞生长特性的影响。我们发现,转染KLF8 siRNA的Lovo细胞在培养24、48和72小时后的生长速率分别为0.6±0.05%,1.22±0.01%和1.72±0.09%,而那些转染src siRNA的Lovo细胞生长速率分别为1±0.05%,1.74±0.07%和2.97±0.05%(图10)。我们发现转染了KLF8 siRNA和src siRNA的Lovo细胞在所有3个时间点生长谏率之间有显著差异(P0.05), SW620细胞中也可以观察到类似的结果(图10)。锚定非依赖性生长是肿瘤恶变的一个关键特征。因此,为确定KLF8的功能我们进行了软琼脂实验。正如预期的那样,压低KLF8表达14天后Lovo和SW620细胞的菌落形成能力得到显著抑制(图11)。因此,敲低KLF8表达抑制了结直肠癌细胞的锚定依赖性和锚定非依赖性生长。5.抑制KLF8表达诱导细胞凋亡并提高癌细胞对化疗药物5-FU的敏感性为了研究敲低KLF8表达诱导癌细胞生长抑制的机制,我们使用Annexin V-FITC和PI双染细胞,随后用流式细胞仪分析,进行细胞凋亡检测。如图12所示,Lovo细胞中凋亡细胞的百分比从转染src-siRNA后的0.81%显著增加到转染KLF8 siRNA后的32.58%,和类似的结果也可见于SW620细胞(从5.71%至24.2%)。使用Hoechst 33258染色使细胞凋亡诱导在个体细胞水平得到进一步证实。我们发现,与转染src-siRNA的Lovo细胞(5±1%,P0.05)相比,细胞核浓缩呈阳性的比例在转染KLF8-siRNA的Lovo细胞(30±2%)中更高(图13)。类似的结果也见于SW620细胞。凋亡蛋白酶3,8和9的活性在转染KLF8 siRNA后得到分析,并且标准化为光密度,其测定在405nm。如图14所示,凋亡蛋白酶3,8和9的活性在转染KLF8 siRNA的细胞中与转染src siRNA的细胞相比显著增高(图14,P0.05)。为了评估KLF8 siRNA在化疗诱导的细胞凋亡中的作用,我们通过流式细胞术分析了转染KLF8 siRNA或src siRNA的细胞分别用或不用5-FU[50μg/m1溶于生理盐水(NS)]处理后的凋亡变化。如图15所示,相对于转染src siRNA的对照组细胞, 转染KLF8 siRNA并5-FU处理组细胞凋亡指数显著增加。此外,我们使用赫斯特33258染色对凋亡细胞形态学改变进行了分析。与src siRNA+5-FU对照组细胞(P0.05)相比,KLF8 siRNA+5-FU组Lovo细胞核浓缩呈阳性的比例增高(图16)。类似的结果见于SW620细胞。结果表明,KLF8 siRNA增强癌细胞对5-FU诱导凋亡触发的敏感性。6.抑制KLF8表达可提高体内癌细胞对5-FU诱导凋亡的敏感性为确定KLF8沉默是否能抑制体内肿瘤的发展,我们将转染慢病毒的Lovo细胞注射到裸鼠的右背侧皮下,同时裸鼠也分为5-FU处理组和非5-FU处理组(图17)。如图18所示,注射转染Lenti-KLF8-shRNA Lovo细胞的裸鼠肿瘤体积相比注射转染lenti-src-shRNA Lovo细胞的裸鼠明显变小(a组和b组)。类似的结果也可在5-FU处理组与非5-FU处理组裸鼠进行比较中发现(c组和d组)。更重要的是,将小鼠同时注射转染Lenti-KLF8-shRNA Lovo细胞和5-FU的裸鼠呈现的肿瘤结节最小。在图19,我们通过蛋白免疫印迹检测了KLF8在四个裸鼠组肿瘤组织中的表达。显然,在同时注射了转染Lenti-KLF8-shRNA的Lovo细胞和5-FU的裸鼠肿瘤组织中,KLF8的表达是最低的。因此,在体内Lenti-KLF8-shRNA与5-FU之间存在协同效应,共同抑制了Lovo细胞增殖。综上所述,这些数据表明,用Lenti-KLF8-shRNA靶向作用于KLF8对体内肿瘤发生有抑制作用。此外, KLF8的抑制与5-FU之间在结直肠癌的治疗中存在协同效应。结论1.免疫蛋白印记和免疫组化实验证实转录因子KLF8在肠癌细胞系和肠癌组织中是高表达的。2.蛋白免疫印迹实验证实肠癌细胞中ERK1／2组成性活化的抑制下调KLF8表达,压低KLF8表达可阻滞ERK信号通路的活化。3. RT-PCR在RNA水平证实压低KLF8表达显著增加分化标志CEA和E-cadherin的表达,同样细胞形态学方面也证实敲低KLF8表达可能诱导结直肠癌细胞的分化。4.WST-1检测和软琼脂克隆形成实验均证实压低KLF8表达可明显抑制肠癌细胞增殖能力,抑制细胞锚定依赖性和锚定非依赖性生长。5.通过流式细胞分析和免疫荧光染色实验证实压低KLF8表达可明显诱导肠癌细胞凋亡并显著增加肠癌细胞对5-FU的敏感性。6.通过裸鼠异种移植成瘤实验,证实压低KLF8表达可明显抑制体内肿瘤增殖,并且Lenti-KLF8-shRNA与5-FU之间存在协同效应,有望为结肠癌治疗提供新的靶点。
【关键词】：KLF8 ERK1/2 F-actin siRNA 慢病毒 结直肠癌
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.34
【目录】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-23
• 前言23-29
• 一、实验材料29-36
• 二、实验方法36-50
• 三、结果50-67
• 1、结肠癌组织中KLF8蛋白表达水平高于正常组织50-52
• 2、ERK1/2组成性活化的抑制下调KLF8表达52-54
• 3、肠癌细胞中压低KLF8表达诱导细胞分化54-56
• 4、敲低KLF8表达抑制细胞锚定依赖性和锚定非依赖性生长56-59
• 5、抑制KLF8表达诱导细胞凋亡并提高癌细胞对化疗药物5-氟尿嘧啶的敏感性59-63
• 6、抑制KLF8表达可提高体内癌细胞对5-氟尿嘧啶诱导凋亡的敏感性63-67
• 四、讨论67-71
• 全文小结71-73
• 参考文献73-80
• 中英文缩略词对照表80-82
• 攻读学位期间论文撰写情况82-83
• 致谢83-84

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 刘元宁;常亚萍;李妼;张浩;田明尧;;针对H1N1病毒的多特征siRNA设计[J];吉林大学学报(工学版);2010年03期

2 冯洁;汤正好;臧国庆;张荣贵;余永胜;;KLF6、Sp1蛋白在肝癌、肝硬化组织中的表达及意义[J];胃肠病学和肝病学杂志;2008年02期

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本文编号：830785