髓源抑制性细胞对结直肠癌发生发展的影响及机制初探

发布时间：2017-09-12 12:32

  本文关键词：髓源抑制性细胞对结直肠癌发生发展的影响及机制初探

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【摘要】：研究背景及目的：结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是全球第三大常见肿瘤,近年来,由于生活方式的改变,发展中国家的结直肠癌发病率呈逐年升高趋势,成为危害公众健康的重大疾病之一。每年新诊断的结直肠癌患者超过130万,每年因结直肠癌导致死亡的则超过60万人。CRC的平均5年生存率为65.0%,但因分期不同而差异较大,大约20%的结直肠癌患者诊断明确时已存在转移,这部分患者的中位生存时间一般小于2年。过去几年,针对结直肠癌的治疗方式如手术、化疗、分子靶向治疗(如抗EGFR(西妥昔单抗)和VEGF(贝伐单抗))等均取得了快速发展[4-7]。这些治疗方法均在一定程度上降低了结直肠癌的死亡率,但由于结直肠癌的原位复发和远隔转移,目前针对mCRC的治疗远没有达到临床预期的效果。近年来,一种具有免疫抑制功能的细胞-MDSCs(myeloid-derived suppressor cells髓源抑制性细胞)得到广泛的研究,MDSCs是未成熟的异质性髓系细胞,在肿瘤患者和动物模型中,MDSCs可以募集到肿瘤微环境、淋巴结、脾脏及外周血中,具有抑制先天和后天抗肿瘤免疫功能。MDSCs是肿瘤免疫抑制最重要的调控者之一,不仅显著抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫,还可通过促进肿瘤血管生成和建立适宜肿瘤转移的微环境等直接促进肿瘤的发生、发展和转移。在荷瘤小鼠中,MDSCs的表型确定为CDllb+ Gr-1+,根据Gr-1的两个亚型：Ly6G和Ly6C,以及另一表面标记CD49d,可将CD11b+Gr-1+MDSCs进一步分为粒系MDSCs(G-MDSCs)CD11b+Gr-1hi Ly-6Clow Ly-6G+CD49d-和单核系MDSCs(Mo-MDSCs) CD11b+Gr-1intLy-6Chi Ly-6G-CD49d+。在结直肠癌患者中,通常将MDSCs表型定义为CD11b+CD33+HLA-DR-, MDSCs在Ⅲ和Ⅳ期结直肠癌患者外周血中水平显著高于健康对照、Ⅰ和Ⅱ期结直肠癌患者,并和肿瘤的转移具有相关性,此外,外周循环中的MDSCs水平和血清中VEGF水平也具有相关性。在慢性炎症-结直肠肿瘤动物模型中,研究者发现通过抑制MDSCs的在肠黏膜的局部浸润可抑制肿瘤的形成。尽管如此,目前有关MDSCs直接促进结直肠癌发生发展的机制研究甚少,MDSCs在结直肠癌肿瘤微环境中和结直肠肿瘤的相互作用目前仍不清楚,MDSCs作为一种不成熟的细胞类型,其在肿瘤微环境中的分化等问题均没有得到阐释。阐明上述问题对于进一步了解MDSCs在肿瘤尤其是结直肠癌中的作用,指导未来肿瘤免疫治疗新方法具有重要意义。目的：为更好地了解肿瘤微环境中MDSCs(髓源抑制性细胞)对结直肠癌发生发展的影响,进一步明确MDSCs(髓源抑制性细胞)和结直肠癌细胞之间相互作用的机制,探索肿瘤微环境中的MDSCs的分化情况,为以MDSCs为靶点,全面摧毁肿瘤微环境的肿瘤治疗新方案提供更多依据。方法1、MDSCs在初诊结直肠癌患者及不同结直肠癌模型中的募集表达情况1.1：新诊断的结直肠癌患者外周血中MDSCs的比例情况分析。收集2012年3月1日至2012年8月1日期间南方医院初诊大肠癌患者42例(平均年龄57.8岁,28-84；男27例,女15例)及健康正常对照19例肝素抗凝静脉血6.0ml,密度梯度离心法提取PBMC,流式细胞技术检测MDSCs (CD11b+CD33+HLA-DR-)细胞比例。1.2：荷瘤小鼠外周血、脾脏、骨髓、肿瘤原位的MDSCs(CD11b+Gr-1+)募集情况分析。应用CT-26结肠癌细胞构建小鼠皮下移植瘤模型,制备外周血PBM C、脾脏、骨髓、肿瘤原位的单细胞悬液,流式细胞术检测其中MDSCs(CD11b+Gr-1+)细胞分布及比例情况；免疫组化检测Gr-1在肿瘤组织中的表达情况。1.3：AOM+DSS诱导的炎症相关结直肠癌模型外周血、脾脏、骨髓中MDSCs (CD11b+Gr-1+)的分布特点。成功构建AOM+DSS诱导的炎症相关结直肠癌模型,行常规组织病理学检测加以验证,评价MDSCs在不同诱导阶段的不同部位的募集情况。2、MDSCs与结直肠癌细胞之间的相互作用2.1:MDSCs对结直肠癌细胞的迁移侵袭能力的影响。采用流式分选技术分选MDSCs,体外与肠癌细胞共培养,应用划痕愈合实验、transwell侵袭小室实验探讨MDSCs对肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响。2.2：HT-29细胞和MDSCs细胞之间的相互作用对促炎因子分泌的影响。应用蛋白质芯片检测技术检测HT-29细胞与MDSCs(CD11b+CD33+HLA-DR-)细胞共培养上清中促炎因子的表达情况。2.3：肿瘤微环境对MDSCs分化的影响。免疫磁珠分选技术分选荷瘤小鼠脾脏MDSCs(CD11b+Gr-1+),将MDSCs在肿瘤微环境中连续培养5天,用流式细胞术检测巨噬细胞表面标记(F4/80：巨噬细胞总群标记,MHCII:M1型巨噬细胞标记,CD206:M2型巨噬细胞)变化情况。3、统计学方法：流式细胞结果先行方差齐性检验,方差齐(P0.05)则行两独立样本t检验,IHC切片随机选取3-5个不同视野,评估目的蛋白的阳性表达情况。应用SPSS13.0软件进行统计学分析,所有数据采用均数±标准差(x±SD)表示,P0.05具有显著性差异。结果：1、MDSCs在初诊结直肠癌患者外周血、不同结直肠癌模型中水平显著高于正常对照组1.1新诊断的结直肠癌患者外周血中MDSCs (CD11b+CD33+HLA-DR)水平明显高于正常对照组。1.2在荷瘤小鼠的外周血、脾脏、骨髓、肿瘤原位中浸润的MDSCs水平明显高于正常对照组。1.3 MDSC s在AOM+DSS炎症-肿瘤相关模型外周血、脾脏、骨髓中的含量与造模时间有明显相关性,并且随着时间的增加呈上升趋势。2、MDSCs与肠癌细胞相互作用改变肿瘤微环境中促炎因子表达水平,促进肿瘤进展及MDSCs分化。2.1 MDSCs与肠癌细胞的共培养上清可明显促进肠癌细胞的迁移能力。2.2 MDSCs可明显促进肠癌细胞的侵袭能力。2.3 MDSCs和HT-29细胞共培养后可明显促进炎性因子的表达。2.4 MDSCs在体外肿瘤微环境中可分化为M2型巨噬细胞。结论1、MDSCs水平在初诊结直肠癌患者外周血,荷瘤小鼠和炎症-肿瘤模型小鼠的外周血、脾脏、骨髓及肿瘤原位中显著升高。2、MDSCs细胞和结直肠癌细胞相互作用产生大量的促炎因子促进结直肠癌细胞的迁移侵袭。3、MDSCs在肿瘤微环境中可分化为M2型巨噬细胞。本研究的创新之处1、首次系统探讨了MDSCs在新诊断结直肠癌患者外周血、小鼠结直肠癌皮下移植瘤模型、AOM+DSs诱导的炎症-肿瘤相关模型中不同部位(外周血、脾脏、骨髓、肿瘤原位中)募集情况。2、采用蛋白芯片技术筛选出了MDSCs与HT-29结肠癌细胞相互作用后高表达的促炎因子。3、提出MDSCs在结直肠肿瘤微环境中可继续分化为M2型巨噬细胞促进肿瘤进展的新观点。
【关键词】：肿瘤微环境 髓源抑制性细胞 结直肠癌 促炎因子 巨噬细胞
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.34
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-29
• 第一章 MDSCS在初诊结直肠癌患者外周血、不同结直肠癌模型中的募集表达情况29-43
• 1. 新诊断的结直肠癌患者外周血中MDSCs(CD11B~+CD33~+HLA-DR~-29-33
• 1.1 实验材料29
• 1..2 统计学分析29-30
• 1.3 实验步骤30-31
• 1..4 结果31-33
• 2. 荷瘤小鼠外周血,脾脏、骨髓、肿瘤原位的MDSCs(CD11B+GR-1+)募集情况分析33-38
• 2.1. 实验材料33
• 2.2 统汁学分析33
• 2.3 实验步骤33-35
• 2.4 结果35-38
• 3 AOM+DSS诱导的炎症相关的结肠癌模型外周血、脾脏、骨髓中MDSCs(CD11B~+GR-1~+)的分布特点38-43
• 3.1 实验材料38
• 3.2 实验步骤38-39
• 3.3 结果39-43
• 第二章 MDSCS与结直肠癌细胞之间的相互作用及机制初探43-56
• 1. MDSCs对结直肠癌细胞的侵袭转移能力的影响43-47
• 1.1 实验材料43
• 1.2 统计学方法43-44
• 1.3 实验步骤44-45
• 1.4 结果45-47
• 2. HT-29细胞和MDSCs(CD11B~+CD33~+HLA-DR~-)细胞之间的相互作用对促炎因子表达的影响47-51
• 2.1 材料试剂48
• 2.2. 实验步骤48-49
• 2.3 结果49-51
• 3. 肿瘤微环境可促进MDSCs分化的影响51-56
• 3.1 实验材料52
• 3.2 统计学方法52
• 3.3 实验步骤52-53
• 3.4 结果53-56
• 讨论56-60
• 全文小结60-62
• 参考文献62-78
• 中英文对照缩略词表78-80
• 致谢80-81
• 成果81-82

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 毕永华;许为青;;血管内皮生长因子和抗血管内皮生长因子药物治疗进展[J];安徽医药;2008年11期

2 王国振;王新颖;;髓源性抑制细胞促进肿瘤侵袭转移的非免疫学机制研究进展[J];广东医学;2014年07期

3 李佳青;韩咏梅;李占海;;香菇多糖对人膀胱癌BIU-87细胞增殖的抑制作用[J];解放军医药杂志;2013年11期

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5 汪雯;张国楠;;抗血管生成药物贝伐单抗在卵巢癌应用中的研究进展[J];肿瘤预防与治疗;2011年01期

6 廖炯博;邵琨;王筱;刘光伟;徐达;周佩军;王祥慧;;地塞米松诱导骨髓来源抑制细胞对同种异系小鼠皮肤移植排斥反应的作用[J];上海交通大学学报(医学版);2014年06期

中国博士学位论文全文数据库 前10条

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2 于s，

本文编号：837277