新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立

发布时间：2017-09-12 19:20

  本文关键词：新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立

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【摘要】：宫颈癌是最常见的女性恶性肿瘤之一,而高危型人乳头瘤病毒(High-risk human papillomavirus,HR-HPV)的持续感染与宫颈癌的发生关系最为密切。目前宫颈癌的发生率逐渐升高,并呈年强化趋势发展,这不仅严重影响着妇女的生活质量,也给妇女的生命及健康带来严重的威胁。因此明确某一地区HPV的感染现状以及流行型别,并了解宫颈病变样本中HPV的基因变异状况,这对指导HPV疫苗的应用推广和新一代疫苗的设计研究以及新的检测方法的建立具有重要的意义。新疆处于我国西北地区,其宫颈癌的发生率较高,尤其是在新疆南部少数民族聚集的区域,但目前对于新疆北疆地区HPV的流行状况以及疫苗还没有研究。本实验对新疆北疆部分地区的HPV的流行状况以及宫颈病变样本中HPV基因型的分布以及多重感染与宫颈病变的关系进行了研究。并在此基础上通过对基因变异情况的分析来研究适合该地区的HPV疫苗和和建立。研究方法和实验结果如下:1.新疆北疆部分地区HPV的流行状况HPV的持续感染是宫颈癌发生的主要原因。为了研究新疆北疆部分地区HPV的流行状况,和宫颈病变人群中HPV基因型的分布,以及多重感染情况。我们收集了2010年1月-2014年12月就诊于新疆石河子大学第一附属医院妇产科进行第二代杂交捕获法(Hybrid Capture 2,HC2)检测的7298位病人的病例资料,并收集了2014年1月-2014年12月就诊病人的宫颈脱落细胞样本,筛选出经病理学诊断有宫颈病变病人的宫颈脱落细胞样本,并对其进行分子检测,结果显示:(1)新疆北疆地区人乳头病毒的发生率仍处于一个较高的水平,其中年龄25岁和≥55岁时出现感染高峰;(2)HR-HPV的检出率随着宫颈病变等级的增加而增加,而低危型人乳头瘤病毒的感染率(Low-risk human papillomavirus,LR-HPV)随宫颈病变程度的变化而变化不大;(3)在新疆北疆部分地区至少存在29种HPV基因型,其中HR-HPV 17种,LR-HPV 12种,其中发生率较高的HR-HPV基因型依次为HPV 16、53、52、58、35;(4)在多重感染检测中,主要以二重感染为主,其中以HPV 16型的合并感染最为常见,还出现了三重、四重、五重、六重感染,并且多重感染与宫颈病变的严重程度无关。2.HPV流行基因型L1基因的克隆与分析为了研究新疆北疆地区流行的主要HR-HPV L1基因的变异情况,设计了能够扩增HPV 16、52、53、58以及在世界范围内发生率较高且致癌性较强的HPV 18型的L1全长序列的引物,并经过测序、拼接、比对后获得L1基因序列全长。通过与现有的疫苗株和美国株序列进行比对后发现,在核酸水平上均发生了突变,有些碱基突变甚至导致了氨基酸的改变。以HPV 16 L1基因为例,对新疆株与疫苗株进行分子生物信息学分析,发现两者之间存在差异。这为新疆北疆地区疫苗的引进以及多价疫苗的研发提供理论依据。同时本章还参照以往报道,筛选出保守性较好的多肽片段,为下一章节单克隆抗体的制备奠定基础。3.HPV 16型单克隆抗体的检测以及双抗体夹心ELISA检测方法的建立为了建立适合新疆北疆地区自身发展特点的HPV检测方法,本研究在实验二的筛选得出的保守片段基础上,对多肽片段进行合成,并进行KLH偶联,然后免疫小鼠,最终获得15株含有单克隆抗体的杂交瘤细胞培养上清,Western blot检测后,筛选出两株特异性较好的细胞株,并对其进行纯化,其中一株纯化的单抗进行辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)标记后作为检测抗体,另一株纯化单抗作为捕获抗体,以此为基础建立检测HPV的双抗体夹心ELISA法。通过对抗体稀释液等条件进行优化,确定捕获抗体的最佳浓度为1.69μg/m L,检测抗体的工作效价为1:100,样品反应时间为45 min;酶标抗体作用时间为40 min;显色时间为15 min,用建立的双抗体夹心ELISA方法与TS-PCR(Type-Specific Polymerase Chain Reaction,TS-PCR)方法同时检测66份临床宫颈脱落细胞样本,符合率达到81.8%,结果表明该方法具有较好的特异性及重复性,可初步应用于HPV的检测。
【关键词】：宫颈癌 宫颈病变 HPV基因型 多重感染 疫苗 双抗体夹心ELISA
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.33
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 中英文缩略词表11-12
• 第一章 文献综述12-27
• 1 HPV的分子结构12-13
• 2 HPV分型及各型别的致病性13-16
• 3 HPV基因型的流行状况16-18
• 4 HPV感染与宫颈癌及癌前病变的关系18
• 5 HPV多重感染与宫颈病变的关系18
• 6 宫颈癌发生的危险因素18-20
• 6.1 病毒因素19
• 6.2 宿主因素19-20
• 7 宫颈癌的预防20-22
• 7.1 宫颈癌的普查20
• 7.2 疫苗预防20-22
• 8 宫颈癌的检测方法22-27
• 8.1 细胞学检查22
• 8.2 感染组织中HPV蛋白的检测22
• 8.3 HPV感染的血清学检查22-23
• 8.4 HPV检测23-24
• 8.5 酶联免疫吸附试验技术24-27
• 第二章27-75
• 实验一 新疆北疆部分地区HPV的流行状况27-47
• 1 材料与方法28-36
• 1.1 材料28-31
• 1.2 方法31-36
• 2 结果36-43
• 2.1 HPV检出率36-37
• 2.2 宫颈脱落细胞样本中HPV感染率37
• 2.3 PCR检测结果37-39
• 2.4 HR-HPV检测39-41
• 2.5 多重感染41-43
• 3 讨论43-47
• 实验二 HPV流行基因型L1基因的克隆与分析47-60
• 1 材料与方法48-50
• 1.1 材料48
• 1.2 方法48-50
• 2 结果50-57
• 2.1 HPV16、58 L1基因的扩增50-51
• 2.2 HPV 18、52 L1基因的扩增51-52
• 2.3 HPV 53 L1基因的扩增52
• 2.4 HPV L1的生物信息分析52-57
• 3 讨论57-60
• 实验三 HPV 16 型单克隆抗体的检测以及双抗体夹心ELISA检测方法的建立60-75
• 1 材料及方法61-67
• 1.1 材料61-63
• 1.2 方法63-67
• 2 结果67-73
• 2.1 杂交瘤细胞培养上清的筛选67-68
• 2.2 双抗体夹心ELISA检测方法建立中各条件的优化68-72
• 2.3 双抗体夹心ELISA方法验证72-73
• 3 讨论73-75
• 全文总结与展望75-77
• 总结75
• 展望75-77
• 参考文献77-84
• 附件 184-85
• 附件 285-87
• 附件 387-89
• 致谢89-90
• 作者简介90-91
• 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅书91

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本文编号：839054