小G蛋白Ran在结直肠癌侵袭转移中的作用与机制研究

发布时间：2017-09-13 04:37

  本文关键词：小G蛋白Ran在结直肠癌侵袭转移中的作用与机制研究

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【摘要】：【背景】结直肠癌是危害人类生命健康的恶性肿瘤之一。最新全球癌症统计结果显示,2012年度全球结直肠癌新发病例140万左右,死亡病例693900,其中发病率在男性中排名第三,女性中排名第二,死亡率在男性中排名第四,女性排名第三。在我国随着人民生活水平的提高,诱发结直肠癌的高危因素也在同步广泛流行,包括人口老龄化的发生、不健康的饮食方式、肥胖、吸烟等,因而近年来结直肠癌的发病率和死亡率呈逐年上升。而肿瘤的转移是结直肠癌致死的主要原因,也是影响患者预后的重要因素。为了探究结直肠癌侵袭转移的机制,我们课题组为此展开了系列研究。MC3是我们实验室前期自主建立的一株结肠癌特异单抗,我们鉴定出其识别的抗原为Txl-2,后期发现Txl-2的剪接体Txl-2b与小G蛋白Ran相互作用,显著促进结肠癌的转移。在此基础上,我们对Ran做了功能学验证和机制探索。结果显示Ran在结直肠癌组织中、胃癌组织中、胰腺癌组织中的表达显著高于正常组织,并且其高表达与肿瘤的分期及转移成正相关[1,2]。在结直肠癌细胞和胰腺癌细胞中,干扰Ran的表达可引起细胞体内体外增殖能力减弱。在胰腺癌细胞,Ran表达的下调可引起细胞凋亡增加,细胞迁移及侵袭能力明显下降,研究还发现其调控机制与细胞周期相关蛋白及存活素Survivin表达下调,凋亡蛋白cleaved Caspase-3表达上调有关。而其促进侵袭转移的机制则与雄激素受体Androgen Receptor、趋化因子CXCR4可能相关。研究至此,尚无直接证据证明Ran可以促进结直肠癌侵袭转移,同时Ran在结直肠癌侵袭转移中的作用机制仍不清楚。【目的】1.检测并分析Ran在结直肠癌中病理组织及细胞系中的表达与转移的关系。2.研究Ran对结直肠癌细胞系迁移侵袭能力的影响。3.探索Ran促进结直肠癌细胞侵袭转移的机制。【方法】1.小G蛋白Ran在组织与细胞中的表达检测:(1)免疫组织化学检测Ran在结直肠癌原发灶和配对阳性淋巴结中的表达,分析Ran的表达强度与结直肠癌转移的关系。(2)Western blot检测Ran在永生化正常肠上皮细胞HIEC、结直肠癌细胞系SW480、SW620、HCT116、Caco-2、HT-29、Lo Vo核蛋白中的表达情况。(3)免疫荧光检测Ran在结直肠癌细胞SW480、SW620的亚细胞定位情况及荧光表达强弱情况。2.构建Ran的功能获得、功能缺失细胞模型:(1)将Ran特异性Oligo si RNA转染入结直肠癌细胞,在蛋白水平验证通过Western blot验证si RNA的干扰效果。(2)将最有效的的si RNA包装构建成慢病毒,稳定下调Ran的表达,并通过Western blot和荧光检测进行验证。(3)构建并转染过表达Ran的慢病毒,并通过Western blot进行过表达验证。3.Ran对结直肠癌细胞侵袭转移能力的影响:(1)体外实验通过Transwell迁移和侵袭实验观察Ran的功能获得和功能缺失细胞模型迁移和侵袭能力的变化。(2)体内实验通过裸鼠尾静脉转移观察Ran功能获得和功能缺失细胞模型在体内侵袭能力的变化。4.Ran调控结直肠癌侵袭转移的机制研究(1)利用Nanostring检测技术探索Ran下游的分子表达变化及可能的信号通路。(2)利用高通量表达谱芯片探索Ran下游的分子表达变化及可能的信号通路。(3)通过RNAi技术、Western blot检测雄激素受体AR、LIN28B与Ran的表达失调的关系,通过Transwell迁移实验验证AR、LIN28B在结直肠癌细胞迁移能力中的影响。【结果】1.在34例结直肠癌组织及其配对的阳性淋巴结标本中,免疫组织化学结果显示Ran在结直肠癌转移灶(阳性淋巴结)中的阳性表达率明显高于结直肠癌原发灶中的表达,P0.05,有统计学意义。2.结直肠癌细胞系及永生化正常肠上皮细胞的核蛋白中Ran表达存在差异,在人永生化正常肠上皮细胞HIEC表达极少,在高转移细胞系SW620、HCT116、Caco-2中Ran的表达明显高于低转移细胞系SW480、HT-29。3.免疫荧光结果显示,Ran主要定位于细胞核中,且高低转移细胞系SW620和SW480中Ran的表达存在差异。4.合成的Ran特异的Oligo siRNA经过转染和验证,si-1干扰效果最好,经过慢病毒包装后,在高转移细胞系HCT116中进行慢病毒转染,经过嘌呤霉素筛选后,通过Western blot和荧光显影检测,成功构建了Ran的表达下调的稳转细胞系HCT116-si Ran及对照HCT116-si NC。5.通过对低转移细胞系SW480进行过表达慢病毒的转染及续嘌呤霉素筛选,成功构建了过表达Ran的稳转细胞系SW480-Ran及对照SW480-NC。6.体外实验Transwell结果显示细胞系HCT116-si Ran的侵袭迁移能力较对照细胞系明显减弱,细胞系SW480-Ran的侵袭迁移能力较对照组明显增强。该结果进行统计学分析有意义。7.体内裸鼠尾静脉转移实验显示细胞系HCT116-si Ran裸鼠肝脏中形成的转移瘤较对照组明显减少,细胞系SW480-Ran在肝脏中形成的转移灶则明显多于对照组,且HCT116-si RAN组裸鼠的生存期较对照组延长,体重动态变化在第18天出现统计学差异。8.细胞系Sw480-Ran中AR与LIN28B的表达均发生了上调,而在Caco-2细胞中,干扰Ran的表达后AR、LIN28B的表达发生了下降。Ran、AR、LIN28B均主要表达在细胞核中,在Ran的表达下调后,AR、LIN28B的荧光表达也相应的减弱。且干扰AR、LIN28B表达后可以减弱结直肠癌细胞的迁移能力。9.通过送检Nanostring以及高通量的表达谱芯片,对Ran的下游分子机制进行探索,筛选出一批差异表达的基因,我们后续将利用这些大数据对Ran下游的信号通路及分子事件进行生物信息学的分析,明确下游事件的发生。【结论】1.Ran在结直肠癌转移灶组织中的表达高于原发灶组织,在高转移结直肠癌细胞系中的表达高于低转移细胞系。2.体内体外实验证明了小G蛋白Ran能够促进结直肠癌细胞的侵袭转移。3.小G蛋白Ran可能是通过AR、LIN28B调控结直肠癌的侵袭转移,作用机制有待进一步深入研究。4.筛选到了大批Ran下游的差异基因,有助于全面分析Ran下游的分子事件。
【关键词】：Ran 结直肠癌 侵袭转移 分子机制
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.34
【目录】：

• 缩略语表6-8
• 中文摘要8-12
• ABSTRACT12-17
• 前言17-18
• 文献回顾18-27
• 第一部分 Ran在结直肠癌病理组织和细胞系中的表达、定位27-38
• 1 材料27-29
• 1.1 细胞系27
• 1.2 组织芯片27
• 1.3 主要实验试剂27-28
• 1.4 主要实验仪器28-29
• 2 方法29-34
• 2.1 细胞培养29
• 2.2 免疫组织化学染色29-31
• 2.3 Western Blot31-33
• 2.4 免疫荧光33-34
• 3 结果34-36
• 3.1 Ran在结直肠癌组织原发灶与转移灶中的表达34-35
• 3.2 Ran在结直肠癌细胞系核蛋白中表达35
• 3.3 Ran在结直肠癌细胞中的亚细胞定位35-36
• 4 讨论36-38
• 第二部分 慢病毒表达载体的构建和Ran功能获得与缺失模型的建立38-46
• 1 材料38-40
• 1.1 Oligo siRNA-Ran的设计合成38
• 1.2 慢病毒包装38-39
• 1.3 主要试剂39-40
• 1.4 主要实验仪器40
• 2 方法40-42
• 2.1 细胞培养40
• 2.2 细胞瞬时转染及干扰效果验证40-41
• 2.3 慢病毒干扰细胞系及转染效率验证41-42
• 3 结果42-45
• 3.1 Oligo siRNA-Ran瞬时转染效果验证42-43
• 3.2 功能缺失模型的建立43-44
• 3.3 功能获得模型的建立44-45
• 4 讨论45-46
• 第三部分 Ran对结直肠癌细胞转移能力的影响46-53
• 1 材料46-47
• 1.1 功能缺失和功能获得的细胞模型46
• 1.2 主要试剂46
• 1.3 主要实验仪器46-47
• 1.4 实验动物47
• 2 方法47-48
• 2.1 细胞培养47
• 2.2 Transwell迁移实验47
• 2.3 Transwell侵袭实验47-48
• 2.4 裸鼠尾静脉转移实验48
• 2.5 统计学分析48
• 3 结果48-50
• 3.1 Transwell法检测Ran对结直肠癌细胞体外系迁移和侵袭能力的影响48-49
• 3.2 裸鼠尾静脉转移实验检测Ran对结直肠癌细胞系体内转移能力的影响49-50
• 4 讨论50-53
• 第四部分 Ran促进结直肠癌细胞侵袭转移的机制研究53-65
• 1 材料53-55
• 1.1 细胞系53
• 1.2Nanostring53
• 1.3 基因芯片53
• 1.4 主要试剂53-54
• 1.5 主要仪器54-55
• 2 方法55-57
• 2.1 细胞培养55
• 2.2 下游靶分子验证55-56
• 2.3 细胞RNA样本送检Nanostring56
• 2.4 细胞RNA样本送检基因芯片56-57
• 3 结果57-63
• 3.1 下游靶分子验证57-59
• 3.2 Nanostring59-61
• 3.3 表达谱芯片61-63
• 4 讨论63-65
• 小结65-66
• 参考文献66-73
• 个人简历和研究成果73-74
• 致谢74

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 范红伟;卢瑗瑗;吴琼;顾勇;安艳新;王新;;Ran在胃癌中的表达及其临床意义[J];现代生物医学进展;2012年08期

2 邓林;卢瑗瑗;孙艺;郭学刚;;小G蛋白Ran对胰腺癌细胞增殖和凋亡的调控[J];现代生物医学进展;2013年04期

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本文编号：841569