共刺激分子B7-H3对食管癌细胞生物学特性的影响及作用机制的研究

发布时间：2017-09-14 08:40

  本文关键词：共刺激分子B7-H3对食管癌细胞生物学特性的影响及作用机制的研究

  更多相关文章： B7-H3 食管癌 迁移 侵袭 凋亡 血管生成 基因芯片

【摘要】：恶性肿瘤严重威胁人类健康,其中以食管癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌等为代表的消化系统肿瘤对患者的威胁最大。深入了解肿瘤的发生、发展机制,发现新的肿瘤治疗靶点意义重大。肿瘤的免疫疗法是继手术、放疗、化疗之后肿瘤治疗的新方向。B7-H3(CD276),一种免疫球蛋白,是B7共刺激分子家族的新成员。B7-H3在多种肿瘤组织中高表达,并与肿瘤的进展密切相关,是肿瘤的潜在治疗靶点。本课题小组始终致力于B7共刺激分子家族在肿瘤中表达意义的研究,前期研究发现,共刺激分子B7-H3在人食管癌组织中高表达,其表达与患者肿瘤浸润深度正相关,与CD8+T细胞浸润数量成负相关。体外敲低食管癌细胞B7-H3的表达可以抑制佛波酯(PMA)诱导的THP-1细胞向M2型巨噬细胞转化。这些研究结果提示,B7-H3可能参与了食管癌的肿瘤进展。在本研究中,首先检测了人食管癌细胞株KYSE-170、Eca-109、TE-13、TE-1、Eca-9706和人正常食管上皮细胞(HEEC)中B7-H3的表达情况,发现B7-H3在食管癌细胞表达明显增高。通过基因转染敲低B7-H3的表达研究其对食管癌细胞生物学特性的影响。通过Agilent表达谱基因芯片,筛选与B7-H3表达相关的基因,探讨B7-H3参与食管癌肿瘤进展可能的作用机制。第一部分共刺激分子B7-H3对食管癌细胞生物学特性的影响目的:研究敲低B7-H3的表达对食管癌细胞生物学特性的影响。方法:1应用实时荧光定量PCR(Real time quantitative PCR,q RT-PCR)和Western Blot法检测人食管癌细胞株KYSE-170、Eca-109、TE-13、TE-1、Eca-9706和人正常食管上皮细胞HEEC中B7-H3 m RNA和蛋白的表达情况。2应用转染Hu SH 29mer sh RNA的方法构建B7-H3稳定低表达的食管癌细胞株Eca-109,并通过Real time PCR、Western Blot法、荧光显微镜观察和流式细胞分析技术(flow cytometry,FCM)检测转染率和对基因的沉默效率。3应用MTS实验和克隆形成实验,检测下调B7-H3表达后对Eca-109细胞增殖能力的影响。4应用划痕实验和Transwell小室侵袭实验,检测下调B7-H3表达后对Eca-109细胞迁移和侵袭能力的影响。5应用流式细胞分析技术,检测下调B7-H3表达后对Eca-109细胞细胞周期及细胞凋亡的影响。6应用血管生成实验,检测下调Eca-109细胞B7-H3表达后其对血管内皮细胞血管生成能力的影响。7应用裸鼠皮下移植瘤模型观察下调B7-H3表达后对Eca-109细胞体内增殖的影响。结果:1实时荧光定量PCR分析结果显示,不同食管癌细胞株B7-H3 m RNA表达水平KYSE-170(1.000±0.000)、Eca-109(3.210±0.609)、TE-13(1.919±0.067)、TE-1(1.399±0.136)、Eca-9706(1.447±0.319)均高于人正常食管上皮细胞HEEC(0.151±0.057),差异有统计学意义(P0.05)。Western Blot与Real time PCR法分析结果相一致。因为B7-H3在Eca-109细胞中表达最高,故选用Eca-109进行后续实验。2成功构建了稳定转染B7-H3沉默质粒sh RNA p-GFP-V-RS和对照无效质粒p-GFP-V-RS TR30007(TR37)的Eca-109细胞,并分别命名为Eca-109 sh B7-H3和Eca-109 TR37。荧光显微镜观察和流式细胞术分析结果显示,基因转染率可达90%以上。Real-Time PCR法分析结果显示,与Eca-109细胞(1.000±0.000)和Eca-109 TR37细胞(1.156±0.198)相比Eca-109 sh B7-H3细胞(0.197±0.042)B7-H3 m RNA表达水平显著降低,对基因表达的沉默效率可达80%,差异有统计学意义(P0.05),而Eca-109细胞和Eca-109 TR37细胞B7-H3 m RNA的表达水平的差异无统计学意义(P0.05),Western Blot与Real time PCR法分析结果相一致。故选用Eca-109 sh B7-H3细胞和Eca-109 TR37细胞进行后续实验。3 MTS实验和克隆形成实验结果显示,Eca-109 sh B7-H3细胞与Eca-109 TR37细胞的体外增殖能力无明显差异(P0.05),流式细胞术分析结果显示,两种细胞的细胞周期变化无明显差异(P0.05),提示敲低B7-H3的表达对食管癌细胞体外增殖能力无明显影响。4划痕实验结果显示,与对照组Eca-109 TR37细胞相比,Eca-109sh B7-H3细胞的平面迁移能力显著下降,划痕12h及24h后损伤愈合明显较慢,差异有统计学意义(P0.05),提示敲低B7-H3的表达可降低Eca-109细胞的平面运动能力。5 Transwell小室侵袭实验结果显示,与对照组Eca-109 TR37细胞相比,Eca-109 sh B7-H3细胞通过人工基底膜的数量显著下降,差异有统计学意义(P0.05),提示敲低B7-H3的表达可降低Eca-109细胞的侵袭能力。6流式细胞术分析结果显示,与对照组Eca-109 TR37细胞相比,Eca-109 sh B7-H3细胞的凋亡率显著升高,差异有统计学意义(P0.05),提示敲低B7-H3的表达可促进Eca-109细胞的凋亡。7血管生成实验结果显示,使用培养Eca-109 sh B7-H3细胞48 h的上清液培养人血管内皮细胞8 h后,人血管内皮细胞形成网状小管的长度显著低于对照组,差异有统计学意义(P0.05),提示敲低B7-H3的表达可降低Eca-109细胞的促血管生成能力。8裸鼠荷瘤实验表明,在荷瘤28天后,实验组(注射Eca-109 sh B7-H3细胞)与对照组(注射Eca-109 TR37细胞)肿瘤的平均生长大小无明显差异(P0.05),提示敲低B7-H3的表达对Eca-109细胞的体内增殖能力无影响。小结:1食管癌细胞B7-H3表达水平显著上调,提示B7-H3可能参与了食管癌的肿瘤进展。2敲低B7-H3表达对食管癌细胞体内外增殖能力无明显影响,但可抑制食管癌细胞的体外迁移、侵袭和促血管生成能力,促进食管癌细胞的凋亡。第二部分沉默B7-H3基因表达对食管癌细胞侵袭能力抑制作用的机制研究目的:探讨敲低B7-H3表达对抑制食管癌细胞侵袭的作用机制方法:1应用Agilent Sure Print G3 Human Gene Expression chip(8×60K,Design ID:039494)对前期构建的Eca-109 sh B7-H3和Eca-109 TR37细胞进行差异基因表达分析,筛选出与B7-H3表达相关的基因。2结合功能实验结果,通过Real time PCR、ELISA和Western Blott技术对筛选出的侵袭相关基因进行验证。结果:1从实验组Eca-109 sh B7-H3细胞与对照组Eca-109 TR37细胞中,筛选出差异表达基因126个,其中49个基因表达显著上调,77个基因表达显著下调,差异倍数=2.0,P0.05。2 ELISA法分析结果显示,与对照组Eca-109 TR37细胞相比,Eca-109sh B7-H3细胞培养上清液中的IL-6、VEGF分泌水平明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。3 Real time PCR和Western Blot法分析结果显示,实验组Eca-109sh B7-H3细胞与对照组Eca-109 TR37细胞相比,磷酸化Jak-2、磷酸化STAT-3、MMP-9、MMP-7的表达水平明显降低,TIMP-1和EFEMP-1的表达水平明显增高,差异有统计学意义(P0.05)。小结:敲低食管癌细胞B7-H3的表达,可通过抑制IL-6的分泌,降低Jak2/STAT3信号通路的活化,减少MMP-7、MMP-9和VEGF的表达,从而抑制食管癌细胞的侵袭和转移。
【关键词】：B7-H3 食管癌 迁移 侵袭 凋亡 血管生成 基因芯片
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.1
【目录】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-14
• 英文缩写14-16
• 引言16-18
• 第一部分 共刺激分子B7-H3对食管癌细胞生物学特性的影响18-53
• 前言18-19
• 材料与方法19-34
• 结果34-36
• 附图36-47
• 附表47-48
• 讨论48-50
• 小结50-51
• 参考文献51-53
• 第二部分 沉默B7-H3基因表达对食管癌细胞侵袭能力抑制作用的机制研究53-83
• 前言53-54
• 材料与方法54-63
• 结果63-65
• 附图65-70
• 附表70-75
• 讨论75-78
• 小结78-79
• 结论79-80
• 参考文献80-83
• 综述 共刺激分子B7-H3与消化系统肿瘤关系的研究进展83-92
• 参考文献88-92
• 致谢92-93
• 个人简历93

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

1 郎媛媛;孟洁;宋晓萌;陈小军;;EFEMP1通过下调MMP-7表达抑制肺癌细胞生长和侵袭[J];中国肺癌杂志;2015年02期

2 Ting Zhang;Bo Jiang;Shi-Tao Zou;Fen Liu;Dong Hua;;Overexpression of B7-H3 augments anti-apoptosis of colorectal cancer cells by Jak2-STAT3[J];World Journal of Gastroenterology;2015年06期

3 曹娜娜;王玲;王珊;单保恩;;共刺激分子B7-H3在人食管鳞癌中的表达及临床意义[J];肿瘤防治研究;2014年12期

4 Kyle J Napier;Mary Scheerer;Subhasis Misra;;Esophageal cancer: A Review of epidemiology, pathogenesis, staging workup and treatment modalities[J];World Journal of Gastrointestinal Oncology;2014年05期

5 Rong Zeng;Lei Duan;Yuke Kong;Yaojun Liang;Xiaolu Wu;Xuequan Wei;Kehu Yang;;Clinicopathological and prognostic role of MMP-9 in esophageal squamous cell carcinoma: a meta-analysis[J];Chinese Journal of Cancer Research;2013年06期

6 陈岩;潘龙;;基因芯片技术研究进展[J];齐齐哈尔医学院学报;2011年17期

7 张骞;盛军;;基因芯片技术的发展和应用[J];中国医学科学院学报;2008年03期

8 ;Relationship between co-stimulatory molecule B7-H3 expression and gastric carcinoma histology and prognosis[J];World Journal of Gastroenterology;2006年03期

，

本文编号：849028