人胰腺导管腺癌细胞PL45的核酸适配体筛选及其靶标鉴定

发布时间：2017-09-14 11:04

  本文关键词：人胰腺导管腺癌细胞PL45的核酸适配体筛选及其靶标鉴定

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【摘要】：胰腺癌是一种恶性程度很高,诊断和治疗都很困难的消化腺恶性肿瘤,是目前最严重的癌症之一,病理类型包括导管腺癌、腺泡细胞癌、小腺体癌、大嗜酸性颗粒细胞性癌等,其中胰腺导管腺癌是胰腺癌中最常见的一种,占胰腺癌发病率的95%,往往晚期时才被发现。目前胰腺癌最有效的治疗手段是手术切除,但是5年生存率仍不足6%,因此发现新的检测胰腺癌特异性的分子探针,寻找新的肿瘤标志物,对于胰腺癌的防治具有重要的作用。为了获得特异性识别胰腺导管腺癌的核酸适配体,我们合成了ssDNA文库,以人胰腺导管腺癌细胞系PL45为靶标细胞,以人永生化胰腺导管上皮细胞系hTERT-HPNE为对照细胞,进行cell-SELEX筛选。通过15轮筛选,发现ssDNA库达到最大富集。利用高通量测序技术,根据序列的同质性,分成了六个家族,挑选了每个家族的第一条用于进一步的鉴定,发现XQ-2能特异性结合人胰腺导管腺癌细胞系PL45,而不结合对照细胞系hTERT-HPNE,结合人胰腺导管腺癌细胞系PL45的解离常数约为82.5nM。通过逐渐删减两端固定序列的方式对筛选出的核酸适配体XQ-2的序列进行分析优化,流式细胞术结果表明经过删减后的核酸适配体XQ-2d与靶细胞PL45的结合能力更强。为了提高核酸适配体在复杂环境中的稳定性,对删减后的核酸适配体XQ-2d进行了化学修饰,发现经甲氧基修饰的删减后的核酸适配体,不仅保持了与靶细胞高效的结合能力,还可以明显提高其稳定性,这有利于其在生物医学中的应用。为了考察核酸适配体在复杂生物环境下的识别性能,本文表征了核酸适配体与临床病理石蜡组织切片以及小鼠活体肿瘤的结合情况,切片结果表明核酸适配体对癌组织的识别效率高达82.5%,远远高于对正常组织的识别。在小鼠活体肿瘤实验中,尾静脉注射5分钟后,在肿瘤位置开始富集,60分钟后富集达到最强,180分钟后肿瘤位置仍有信号,表明核酸适配体在复杂环境中仍能保持良好的识别能力,并且保持高度的组织特异性。目前胰腺导管腺癌的肿瘤标志物较少,无特异性,且用途不广,十分有必要发现胰腺导管腺癌新的肿瘤标志物十分有必要,本文利用生物质谱、siRNA干扰技术、流式细胞术、SDS-PAGE、western blot等技术成功发现并验证了核酸适配体的靶标蛋白转铁蛋白受体1,利用核酸适配体与其靶标蛋白转铁蛋白受体1特异性结合的特性,发现的这种蛋白质有望作为胰腺导管腺癌新的肿瘤标志物,为胰腺导管腺癌的治疗提供了新的方法和思路。
【关键词】：核酸适配体 cell-SELEX 人胰腺导管腺癌 PL45 靶蛋白
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.9
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 中英文缩写对照9-13
• 第1章 绪论13-21
• 1.1 核酸适配体与SELEX13-16
• 1.1.1 核酸适配体13-14
• 1.1.2 SELEX14-16
• 1.2 核酸适配体在肿瘤研究中的应用16-19
• 1.2.1 核酸适配体与肿瘤的靶向治疗16-18
• 1.2.2 核酸适配体在肿瘤标志物的发现与检测中的应用18-19
• 1.3 本论文开展的工作19-21
• 1.3.1 基于cell-SELEX筛选人胰腺导管腺癌细胞PL45的核酸适配体19
• 1.3.2 人胰腺导管腺癌细胞系PL45核酸适配体靶标的寻找与鉴定19-21
• 第2章 基于cell-SELEX筛选人胰腺导管腺癌细胞系PL45的核酸适配体21-35
• 2.1 前言21-22
• 2.2 实验部分22-30
• 2.2.1 实验中用到的试剂、核酸序列、细胞系及仪器22-24
• 2.2.2 设计文库与引物24-25
• 2.2.3 优化PCR程序中的退火温度25
• 2.2.4 实验中用到的细胞系及其培养25-26
• 2.2.5 细胞和文库的准备26
• 2.2.6 正向筛选26-27
• 2.2.7 反向筛选27-28
• 2.2.8 制备ssDNA文库28
• 2.2.9 筛选过程中筛选压力的调整及循环筛选28-29
• 2.2.10 检测筛选进程29-30
• 2.2.11 高通量测序30
• 2.3 实验结果30-34
• 2.3.1 PCR退火温度的优化30-31
• 2.3.2 筛选文库的富集31
• 2.3.3 富集文库的高通量测序及核酸适配体的明确31-33
• 2.3.4 XQ-2与不同细胞系结合能力的分析33-34
• 2.4 实验小结34-35
• 第3章 XQ-2序列的优化修饰及初步应用35-49
• 3.1 前言35
• 3.2 实验部分35-42
• 3.2.1 实验中用到的核酸序列、仪器和试剂35-37
• 3.2.2 XQ-2序列的删减优化37-38
• 3.2.3 核酸适配体亲和力的考察38
• 3.2.4 核酸适配体的竞争性考察38-40
• 3.2.5 温度对XQ-2d与PL45细胞结合能力的影响40
• 3.2.6 核酸适配体稳定性的考察40-41
• 3.2.7 核酸适配体在临床病理组织切片中的检测41-42
• 3.2.8 核酸适配体在活体胰腺癌移植瘤中的成像42
• 3.3 实验结果42-48
• 3.3.1 XQ-2序列的优化42-43
• 3.3.2 核酸适配体的特点43-46
• 3.3.3 核酸适配体在组织切片与肿瘤活体成像中的应用46-48
• 3.4 实验小结48-49
• 第4章 XQ-2d结合人胰腺导管腺癌细胞系PL45的靶标发现49-59
• 4.1 前言49-50
• 4.2 实验部分50-55
• 4.2.1 核酸序列、试剂仪器与溶液配制50-52
• 4.2.2 XQ-2d的靶标类型52-53
• 4.2.3 收集膜蛋白样品53
• 4.2.4 蛋白上样样品的制备53-54
• 4.2.5 SDS-PAGE电泳54-55
• 4.3 实验结果55-57
• 4.3.1 XQ-2d的靶标类型分析55
• 4.3.2 5'-T(6)-XQ-2d与PL45细胞结合的能力分析55-56
• 4.3.3 质谱鉴定XQ-2d结合的蛋白质56-57
• 4.4 实验小结57-59
• 第5章 XQ-2d结合胰腺导管腺癌细胞系PL45的靶标鉴定59-72
• 5.1 前言59
• 5.2 实验部分59-67
• 5.2.1 实验中所用到的仪器试剂以及核酸序列与溶液配制59-60
• 5.2.2 XQ-2d-pull down实验60-61
• 5.2.3 验证4条干扰序列的干扰效果61-63
• 5.2.4 检测XQ-2d与有效干扰之后的PL45细胞的结合63-64
• 5.2.5 XQ-2d与CD71蛋白的共定位64-65
• 5.2.6 抗体的Kd值,抗体与XQ-2d的竞争性分析65-67
• 5.3 实验结果67-71
• 5.3.1 XQ-2d与CD71蛋白在人胰腺导管腺癌细胞PL45的定位分析67
• 5.3.2 Aptamer-pull down检测XQ-2d结合的蛋白是CD71蛋白67-68
• 5.3.3 干扰实验68-69
• 5.3.4 XQ-2d与CD71抗体的竞争分析69-71
• 5.4 实验小结71-72
• 结论72-73
• 参考文献73-80
• 附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录80-81
• 致谢81-82

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本文编号：849638