miR-185调控肝癌细胞侵袭迁移的分子机制

发布时间：2017-09-14 17:11

  本文关键词：miR-185调控肝癌细胞侵袭迁移的分子机制

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【摘要】：目的探讨miR-185在人肝癌细胞和正常肝细胞中的差异表达以及miR-185对肝癌细胞生长增殖、侵袭和迁移能力的影响,并确定miR-185直接作用的靶基因,以期为肝癌发生发展、侵袭转移的具体分子机制提供理论依据,并为肝癌的早期诊断和发现治疗性靶标提供理论基础。方法1构建miR-185过表达载体pc DNA3/pri-miR-185,合成miR-185的反义寡聚核苷酸miR-185 ASO(ASO-185),然后经脂质体转染人肝癌细胞系Hep G2和SMMC-7721,实验分为四组,转染pc DNA3/pri-miR-185质粒组(miR-185组)、转染pc DNA3空载质粒组(pc DNA3组)、转染ASO-185组(ASO-185组)和转染乱序寡聚核苷酸组(ASO-NC)。2实时荧光定量PCR技术检测过表达miR-185以及miR-185功能受抑制后肝癌细胞Hep G2中miR-185 m RNA表达水平的变化。3运用CCK-8和细胞克隆形成实验观察miR-185对肝癌细胞系Hep G2和SMMC-7721增殖能力的影响。4采用Transwell小室实验观察miR-185对肝癌细胞系Hep G2和SMMC-7721侵袭和迁移能力的影响。5生物信息学数据库预测结合基因芯片结果确定miR-185的侯选靶基因NR1D1并利用荧光报告载体实验验证miR-185对靶基因的直接调控作用。6利用实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测过表达miR-185以及miR-185功能受抑制后肝癌细胞系Hep G2和SMMC-7721中靶基因NR1D1 m RNA和蛋白表达水平的变化。结果1实时荧光定量PCR实验结果显示,在肝癌细胞Hep G2中过表达miR-185后,与pc DNA3组比较,miR-185组细胞中miR-185 m RNA表达水平升高,差异具有统计学意义(P0.01);封闭细胞中内源性miR-185的功能后,与ASO-NC组比较,ASO-185组细胞中miR-185 m RNA表达水平降低,差异具有统计学意义(P0.01)。2 CCK-8实验结果显示,在肝癌细胞系Hep G2和SMMC-7721中过表达miR-185后,与pc DNA3组比较,miR-185组细胞增殖减慢,差异均具有统计学意义(P0.01);封闭细胞中内源性miR-185的功能后,与ASO-NC组比较,ASO-185组细胞增殖加快,差异均具有统计学意义(P0.01)。3细胞克隆形成实验结果显示,在肝癌细胞系Hep G2和SMMC-7721中过表达miR-185后,与pc DNA3组比较,miR-185组细胞克隆形成能力下降,差异均具有统计学意义(P0.01);封闭细胞中内源性miR-185的功能后,与ASO-NC组比较,ASO-185组细胞克隆形成能力增强,差异均具有统计学意义(P0.01)。4 Transwell小室实验结果表明,在Hep G2和SMMC-7721中过表达miR-185后,与pc DNA3组相比,miR-185组细胞侵袭和迁移能力明显降低,差异均具有统计学意义(P0.01);封闭细胞中内源性miR-185的功能后,与ASO-NC组比较,ASO-185组细胞侵袭和迁移能力明显增强,差异均具有统计学意义(P0.01)。5生物信息学数据库预测结合基因芯片、荧光报告载体实验验证,NR1D1是miR-185的直接靶基因。6在Hep G2和SMMC-7721中过表达miR-185后,与pc DNA3组比较,miR-185组细胞中NR1D1 m RNA和蛋白的表达水平降低,差异均具有统计学意义(P0.01);封闭细胞中内源性miR-185的功能后,与ASO-NC组比较,ASO-185组细胞中NR1D1 m RNA和蛋白的表达水平升高,差异均具有统计学意义(P0.01)。结论1 miR-185抑制肝癌细胞系Hep G2和SMMC-7721的增殖和克隆形成能力。2 miR-185抑制肝癌细胞系Hep G2和SMMC-7721的侵袭和迁移能力。3 miR-185可以负性调节Hep G2和SMMC-7721中NR1D1 m RNA和蛋白的表达水平,提示NR1D1是miR-185的直接靶基因,miR-185可能通过靶定NR1D1起到抑癌基因的作用。
【关键词】：miR-185 肝癌细胞 增殖 侵袭 迁移
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 英文缩略表11-13
• 引言13-15
• 第1章 miR-185对肝癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响15-29
• 1.1 实验材料和仪器15-16
• 1.1.1 实验细胞系和质粒15
• 1.1.2 实验试剂15-16
• 1.1.3 实验仪器16
• 1.2 实验方法16-20
• 1.2.1 qRT-PCR检测miR-185 mRNA的表达水平16-18
• 1.2.2 CCK-8 实验检测肝癌细胞的增殖能力18-19
• 1.2.3 集落形成实验检测肝癌细胞的集落形成能力19-20
• 1.2.4 Transwell实验检测肝癌细胞的侵袭和迁移能力20
• 1.2.5 统计学处理20
• 1.3 结果20-25
• 1.3.1 过表达或封闭细胞中内源性miR-185后肝癌细胞中miR-185的表达水平20-22
• 1.3.2 miR-185对肝癌细胞HepG2和SMMC-7721增殖能力的影响22-23
• 1.3.3 miR-185对肝癌细胞HepG2和SMMC-7721集落形成能力的影响23
• 1.3.4 miR-185对肝癌细胞HepG2和SMMC-7721侵袭能力的影响23-24
• 1.3.5 miR-185对肝癌细胞HepG2和SMMC-7721迁移能力的影响24-25
• 1.4 讨论25-27
• 1.5 小结27-29
• 第2章 确定miR-185在肝癌细胞中的靶基因29-51
• 2.1 实验试剂和仪器29-31
• 2.1.1 实验细胞系29
• 2.1.2 实验试剂29-30
• 2.1.3 实验仪器30-31
• 2.2 实验方法31-41
• 2.2.1 qRT-PCR检测细胞中miR-185和NR1D1 mRNA的表达水平31-33
• 2.2.2 Western blotting检测细胞中NR1D1蛋白的表达水平33-34
• 2.2.3 miR-185候选靶基因的筛选34-35
• 2.2.4 荧光报告载体的构建35-39
• 2.2.5 荧光报告载体实验39-40
• 2.2.6 qRT-PCR检测miR-185对肝癌细胞中NR1D1 mRNA表达水平的影响40
• 2.2.7 Western blotting检测miR-185对肝癌细胞中NR1D1蛋白表达水平的影响40-41
• 2.2.8 统计学处理41
• 2.3 结果41-48
• 2.3.1 LO2、HepG2和SMMC-7721细胞中miR-185和NR1D1 mRNA的表达水平41-42
• 2.3.2 LO2、HepG2和SMMC-7721细胞中NR1D1蛋白的表达水平42-43
• 2.3.3 miR-185候选靶基因的筛选43
• 2.3.4 荧光报告载体的构建43-45
• 2.3.5 荧光报告载体实验验证NR1D1是miR-185的直接靶基因45
• 2.3.6 miR-185对肝癌细胞中NR1D1 mRNA表达水平的影响45-48
• 2.3.7 miR-185对肝癌细胞中NR1D1蛋白表达水平的影响48
• 2.4 讨论48-50
• 2.5 小结50-51
• 参考文献51-55
• 第3章 综述microRNA与肝癌关系的研究进展55-68
• 3.1 肝癌的研究现状55
• 3.2 miRNA与肿瘤的关系55-56
• 3.3 miRNA的生物合成56-57
• 3.4 miRNA与肝细胞癌57-58
• 3.5 具有癌基因作用的miRNA58-59
• 3.5.1 miR-2158
• 3.5.2 miR-2558
• 3.5.3 miR-221和miR-22258-59
• 3.5.4 miR-22459
• 3.6 具有抑癌基因作用的miRNA59-62
• 3.6.1 miR-159-60
• 3.6.2 miR-2660-61
• 3.6.3 miR-12261-62
• 3.6.4 miR-37562
• 3.7 小结62-63
• 参考文献63-68
• 结论68-69
• 致谢69-70
• 导师简介一70-71
• 导师简介二71-72
• 作者简介72-73
• 学位论文数据集73

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