绿色荧光蛋白标记白血病K562细胞耐药性的诱导及其生物学特性研究

发布时间：2017-09-16 06:28

  本文关键词：绿色荧光蛋白标记白血病K562细胞耐药性的诱导及其生物学特性研究

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【摘要】：目的：以转基因技术建立绿色荧光蛋白(GFP)基因标记白血病K562细胞,建立荧光白血病细胞模型,并在体外采用逐步提高抗肿瘤药物阿霉素浓度、长期诱导的方法诱导建立GFP标记的荧光白血病多药耐药细胞模型,据此建立便捷、实用、经济、可动态观察的抗肿瘤药物筛选的研究平台,探讨其在抗白血病药物和耐药干预药物筛选中的应用价值。方法：1.构建GFP表达质粒重组质粒pCI-neo-GFP,转入白血病K562细胞,筛选出稳定表达GFP的K562-GFP细胞株,模拟临床化疗过程、从0.01mg/L阿霉素开始采用逐步提高浓度、长期、间歇刺激的方法诱导K562-GFP细胞,直至其能够耐受8 mg／L阿霉素,获得具有稳定多药耐药特性的K562-GFP/ADM细胞。2.采用MTT比色法动态观察K562-GFP及K562-GFP/ADM细胞的增殖活性及对长春新碱、三氧化二砷、阿霉素、柔红霉素、5。氟尿嘧啶、紫杉醇、吡柔比星、依托泊苷等的敏感性；光镜和电子显微镜分别观察细胞形态学变化,甲基纤维素半固体培养法测定细胞集落形成能力。采用RT-PCR法和Western blot法检测耐药相关基因]mdrl/P-gp、mrp1、MRP1、bcrp/BCRP的表达。流式细胞术检测细胞周期分布、P-gp表达阳性率和白血病干细胞含量。3.以K562-GFP和K562-GFP/ADM细胞为细胞模型,研究白藜芦醇与三氧化二砷的联合抗耐药性白血病作用。采用MTT法检测细胞增殖抑制,AnnexinV/PI双标记法检测细胞凋亡；流式细胞术、定量RT-PCR和Western blot法测定凋亡及耐药相关基因NF-κB、Bcl-2、Bzx、P53、caspase-3、mdrl、bcrp和mrpl等的表达。结果：1.GFP基因转染K562细胞,经筛选建立的K562-GFP细胞能稳定表达GFP,表达率达95%以上,且细胞荧光强度高。K562-GFP细胞的形态学和增殖特性与K562细胞无明显差异。2.采用逐步提高阿霉素药物浓度、间断诱导的方法,历时14个月成功诱导了能耐受8.0mg/L阿霉素的K562-GFP/ADM多药耐药株。K562-GFP/ADM细胞对阿霉素的耐受性为亲本K562-GFP细胞的115.81倍,且与长春新碱、柔红霉素、吡柔比星、5-氟尿嘧啶、依托泊苷和紫杉醇等化疗药物交叉耐药,但其对三氧化二砷无耐受性。经阿霉素长期诱导产生耐药性后,K562-GFP/ADM细胞体积较小、核/质比较大,细胞周期分布中G0/G1期细胞增高而S期细胞降低,但撤除药物约60天时,细胞周期分布恢复接近K562-GFP细胞水平。与亲本K562-GFP细胞相比,K562-GFP/ADM细胞具有较强的集落形成能力,细胞群体中LSC含量约为K562-GFP细胞的210倍。阿霉素诱导过程中,K562-GFP细胞耐药相关基因mdr1、mrpl和bcrp的表达水平逐渐增高,当细胞能够耐受浓度8 mg/LADM时,mdrl、mrpl和bcrp基因的表达量分别增高132.5倍、2.85倍和8.87倍。K562-GFP/ADM细胞P-gp阳性率接近100%,撤除药物后继续培养细胞P-gp阳性率稳定不变。3. K562-GFP/ADM细胞与亲本K562-GFP细胞均对三氧化二砷敏感,白藜芦醇可提高三氧化二砷的敏感性。20 μmol/L和40 μmol/L白藜芦醇分别与2 μmol/L三氧化二砷联合作用24-72h,结果显示白藜芦醇显著增强三氧化二砷对K562-GFP/ADM细胞和K562-GFP细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用,尤以K562-GFP/ADM细胞为甚。2 μmol/L三氧化二砷诱导K562-GFP和K562-GFP/ADM细胞的凋亡率分别为51.88%和54.88%,而2 μmol/L三氧化二砷与40 μmol/L白藜芦醇联合则分别为77.64%和99.36%。2 μmol/L 三氧化二砷与40 μmol/L白藜芦醇联合显著降低K562-GFP/ADM细胞耐药基因Jndrl/P-gp mrpl/MRP1和bcrp/BCRP以及凋亡抑制基因bcl-2、NF-κB和P53基因的表达,增强bax表达和caspase-3的活化。结论：1成功建立了表达绿色荧光蛋白(GFP)的K562-GFP细胞,并应用阿霉素诱导其建立了具有典型多药耐药特性的K562-GFP/ADM耐药细胞株,可应用于抗白血病药物和耐药干预药物的筛选。2白藜芦醇显著增强三氧化二砷对K562-GFP/ADM耐药细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用,其作用机制与其降低耐药细胞耐药基因及凋亡抑制基因表达、增强凋亡基因的表达有关。
【关键词】：白血病 绿色荧光蛋白 多药耐药 ABC转运蛋白 凋亡相关基因 三氧化二砷 白藜芦醇 细胞凋亡
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.7
【目录】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 第一章 白血病多药耐药机制及干预对策研究现状11-39
• 1 前言11
• 2 白血病多药耐药相关机制11-20
• 3 白血病干细胞与多药耐药20-23
• 4 白血病多药耐药的干预23-26
• 5 三氧化二砷与白血病治疗26-30
• 参考文献30-39
• 第二章 绿色荧光蛋白标记白血病K562细胞的建立39-48
• 1 前言39
• 2 材料和方法39-42
• 2.1 仪器与试剂39-40
• 2.2 方法40-42
• 3 结果42-44
• 3.1 K562-GFP细胞与K562细胞的增殖活性比较42
• 3.2 倒置荧光显微镜下K562-GFP细胞的形态和GFP荧光42-43
• 3.3 K562-GFP细胞GFP的表达和GFP标记率43-44
• 4 讨论44-45
• 小结45-46
• 参考文献46-48
• 第三章 GFP标记白血病K562细胞耐药性的诱导48-71
• 1 前言48
• 2 材料与方法48-56
• 2.1 仪器与试剂48-51
• 2.2 方法51-56
• 3 结果56-67
• 3.1 白血病K562-GFP细胞的耐药性及交叉耐药性56-58
• 3.2 K562-GFP/ADM细胞的形态学变化58-60
• 3.3 K562-GFP/ADM细胞的细胞周期分布60-62
• 3.4 K562-GFP细胞耐药相关基因和蛋白的表达62-64
• 3.5 K562-GFP/ADM细胞群体中LSC含量的变化64-65
• 3.6 K562-GFP/ADM细胞的集落形成能力65-67
• 4 讨论67-69
• 小结69-70
• 参考文献70-71
• 第四章 白藜芦醇与三氧化二砷联合诱导耐药性白血病K562-GFP/ADM细胞凋亡71-102
• 1 前言71
• 2 材料与方法71-77
• 2.1 仪器与试剂71-73
• 2.2 方法73-77
• 3 结果77-97
• 3.1 As_2O_3对K562-GFP/ADM细胞的增殖抑制作用77
• 3.2 Rsv对K562-GFP/ADM细胞的增殖抑制作用77-78
• 3.3 Rsv增强As_2O_3对K562-GFP/ADM细胞的增殖抑制作用78-80
• 3.4 Rsv增强As_2O_3对K562-GFP/ADM细胞的凋亡诱导作用80-97
• 4 讨论97-99
• 小结99-100
• 参考文献100-102
• 结论102-103
• 缩略词表103-106
• 攻读学位期间完成的科研成果106-107
• 致谢107

【引证文献】

中国重要会议论文全文数据库 前3条

1 支蕾;张轶群;于凡;邢海燕;唐克晶;田征;饶青;王敏;王建祥;;N-cadherin和Tie2在CD34+/CD38-/CD123+白血病干细胞的表达及其作为白血病干细胞标志的初步研究[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年

2 黄明;孟凡义;;Bortezomib或联合三氧化二砷逆转HL60/ADM细胞耐药及其机制的研究[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年

3 蔡宝;刘岸;魏为添;林胜璋;;三氧化二砷和吉西他滨在抗胰腺癌裸鼠移植瘤体内生长中的协同作用[A];2009年浙江省外科学学术年会论文汇编[C];2009年

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本文编号：861428