Kruppel样因子8通过上调FLT1促进769-P肾癌细胞株体外增殖

发布时间：2017-09-16 05:33

  本文关键词：Kruppel样因子8通过上调FLT1促进769-P肾癌细胞株体外增殖

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【摘要】：目的：在肾透明细胞癌细胞系786-O细胞株中瞬时敲低Kruppel样因子8(Kruppel like factor 8, KLF8)的表达能够抑制786-O细胞系的增值,但KLF8在肾癌中的作用机制并不清楚,既往的研究表明,在肾癌中VHL突变导致的VEGF/VEGFR、 PDGFβ/PAGFRβ、TGF/EGFR过度激活,在肾癌的发生发展中起重要作用,本研究旨在探讨过表达KL8基因对肾透细胞癌细胞系769-P的增值能力的影响,以及该作用是否与上述经典通路有关,其作用靶点是什么。方法：应用慢病毒包装系统构建重组KLF8质粒,与空载体质粒分别转染293V细胞进行病毒包装,再分别感染769-P细胞株,利用实时荧光定量PCR技术(Real TimePCR)及Western blot技术检测769-P细胞KLF8的表达情况。根据769-P细胞感染重组KLF8慢病毒或空载体将其分为两组进行功能实验,用平板克隆实验及MTS方法检测769-P细胞增殖能力的变化,应用流式细胞学技术检测细胞周期变化。应用Western blot技术检测潜在靶基因在过表达KLF8组和转染空质粒组中的表达情况。应用siRNA (small interference RNA)技术敲低FLT1后根据FLT1蛋白表达量筛选出敲低效果最明显的siRNA。分别在转染pLV-EGFP (2A) Puro-KLF8质粒和pLV-EGFP (2A) Puro空载体质粒的769-P细胞中转染siFLT1,再应用平板克隆实验,MTS实验检测769-P细胞株增殖能力的变化。结果：①成功筛选出高表达KLF8基因的769-P细胞株,转染pLV-EGFP (2A) Puro-KLF8组的KLF8蛋白表达较对照组显著上调。②平板克隆实验：转染pLV-EGFP (2A) Puro-KLF8组较空载体组克隆数明显增多(P0.05). ③MTS实验，，在48h、72h、96h的检测中,实验组在490nm吸光值显著升高(P0.05)。④流式细胞学检测细胞周期,转染pLV-EGFP (2A) Puro-KLF8组G0/G1细胞比例明显减少S期细胞比例增加。⑤Western blot检测发现FLT1在实验组中表达显著上升。⑥应用siFLTl敲低FLT1后,769-P细胞株的增值能力明显下降,平板克隆实验：769P-KLF8+control克隆数最多,769P-KLF8+siFLT1与769P-EMPTY+control组次之，769-P-EMPTY+siFLT1克隆数最少;MTS:769P-KLF8+control组于72h,96h时间点在490nm处光吸收值最高,769P-KLF8+siFLT1与769P-EMPTY+control组次之，769-P-EMPTY+siFLT1最低(P0.05)。结论：KLF8基因过表达能够促进肾透明细胞癌细胞系769-P的增值,并且该增值效应依赖于FLT1(即VEGFR1)的表达升高。
【关键词】：Kruppel样因子8 肾透明细胞癌 调控机制
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.11
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-11
• 第一部分 KLF8过表达后对肾透明细胞癌增殖能力的影响11-20
• 1. 材料与方法11-14
• 2. 结果14-19
• 3. 小结19-20
• 第二部分 KLF8过表达后靶基因的筛选及siFLT1的筛选20-26
• 1. 材料与方法20-23
• 2. 结果23-25
• 3. 小结25-26
• 第三部分 抑制FLT1表达后对769-P细胞增殖能力的影响26-30
• 1. 材料与方法26-27
• 2. 结果27-29
• 3. 小结29-30
• 讨论及结论30-31
• 参考文献31-33
• 文献综述：KLF8在肿瘤中的研究进展33-42
• 参考文献38-42
• 英文略缩词表42-43
• 攻读学位期间发表论文43-44
• 致谢44-45

本文编号：861199