家族性甲状腺乳头状癌及甲状旁腺细胞系建立的相关研究

发布时间：2017-09-16 13:05

  本文关键词：家族性甲状腺乳头状癌及甲状旁腺细胞系建立的相关研究

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【摘要】：目的:建立家族性甲状腺乳头状癌(FPTC)永生化细胞系,为研究家族性非髓样甲状腺癌(FNMTC)提供新的途径;建立甲状旁腺(Parathyroid Gland)细胞系并进行微囊化,为甲状旁腺移植提供新的途径。方法:选取FPTC患者的肿瘤标本,采用消化法分离原代细胞;使用改良的DMEM/F12培养基,添加促甲状腺激素(TSH)、三碘甲状腺原氨酸(T3)、表皮细胞生长因子(EGF)及氢化可的松等因子进行培养;在原代细胞早期分两种方式导入外源基因猿猴病毒40大T抗原(SV40T)/端粒酶逆转录酶(TERT)用于诱导永生化;利用RT-PCR检测甲状腺过氧化物酶(TPO)、甲状腺球蛋白(TG)、促甲状腺激素受体(TSHR)、钠/碘共同转运体(NIS)等基因的表达,同时利用免疫荧光技术检测TPO及磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)蛋白的表达;提取该患者外周血DNA,进行突变基因的检测;提取细胞及肿瘤组织基因组PCR扩增后测序,进行突变基因的检测。选取甲状旁腺腺瘤患者的肿瘤标本,采用消化法分离细胞;使用RPMI 1640培养基进行培养;待细胞稳定传代后,进行微囊化,观察细胞生长情况及微囊的稳定性;培养中多次检测甲状旁腺激素(PTH)等因子的水平。结果:分离的FPTC原代细胞呈梭形或不规则多角形贴壁生长;细胞生长6个月,转染SV40T组(标记为FPTC-S)传代至p26,FPTC细胞传代至p23,转染SV40T+TERT组(标记为FPTC-ST)传代至p19,细胞增殖能力较好;FPTC-S与FPTC-ST细胞均能够在基因水平稳定表达TPO、TG与TSHR;患者外周血中存在MLH1 R217C胚系突变;原代细胞及部分肿瘤组织中存在BRAF V600E突变;原代细胞及永生化的细胞系中均存在MLH1 R217C基因突变。分离的甲状旁腺腺瘤原代细胞贴壁生长,呈两种形态,一种为圆形细胞,倒置显微镜下可见黄色荧光;另一种为短梭形细胞,散在分布于圆形细胞中,其形态分别与甲状旁腺的主细胞及嗜酸细胞相近,细胞可以稳定传代至p15代;微囊化后,细胞可正常生长,并且没有破坏微囊结构。结论:本研究初步建立了FPTC永生化细胞系,且该细胞系中存在MLH1 R217C及BRAF V600E突变,该细胞系将为研究以上突变及其相互作用关系提供研究模型;同时,本研究初步探索了甲状旁腺腺瘤组织的分离及培养方法,并进行了微囊化实验,为甲状旁腺移植提供了新的研究方法。
【关键词】：家族性甲状腺乳头状癌 甲状旁腺功能低下 细胞系 原代培养 MLH1 BRAF 微囊化 甲状旁腺激素
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R736.1
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语/符号说明10-12
• 前言12-15
• 研究现状、成果12-13
• 研究目的、方法13-15
• 一、家族性甲状腺乳头状癌永生化细胞系的建立及鉴定15-45
• 1.1 对象和方法15-34
• 1.1.1 研究对象15
• 1.1.2 材料15-20
• 1.1.3 方法20-34
• 1.2 结果34-40
• 1.2.1 原代细胞的培养生长情况34-36
• 1.2.2 原代细胞永生化细胞系的建立36-38
• 1.2.3 细胞的基因表达及蛋白表达检测38
• 1.2.4 突变基因检测结果38-40
• 1.3 讨论40-44
• 1.3.1 原代细胞的分离及培养40
• 1.3.2 永生化细胞系的建立40-41
• 1.3.3 细胞系中的基因突变41-44
• 1.4 小结44-45
• 二、甲状旁腺细胞系建立及微囊化移植的初步研究45-54
• 2.1 对象和方法45-48
• 2.1.1 研究对象45
• 2.1.2 试剂与仪器45-46
• 2.1.3 方法46-48
• 2.2 结果48-51
• 2.2.1 原代细胞的培养生长情况48-49
• 2.2.2 细胞微囊化实验结果49-50
• 2.2.3 甲状旁腺激素的测定结果50-51
• 2.3 讨论51-53
• 2.3.1 原代细胞的分离及培养51
• 2.3.2 甲状旁腺细胞的微囊化51-52
• 2.3.3 甲状旁腺素的测定52-53
• 2.4 小结53-54
• 结论54-55
• 参考文献55-60
• 发表论文和参加科研情况说明60-61
• 综述 家族性甲状腺乳头状癌及人甲状腺癌细胞体外培养的研究进展61-71
• 综述参考文献66-71
• 致谢71-72
• 个人简历72

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本文编号：863204