疟原虫遗传减毒子孢子的抗肺癌作用及机制研究

发布时间：2017-09-16 23:15

  本文关键词：疟原虫遗传减毒子孢子的抗肺癌作用及机制研究

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【摘要】：肺癌仍然是世界上常见的恶性肿瘤之一,其中NSCLC占肺癌总数的85%,其发病率和死亡率高,意味着没有有效的治疗方法。尽管随着外科手术、化疗、放疗、分子靶向药物治疗等的不断进展,但是肺癌的疗效仍然不理想。近年来对肿瘤与免疫系统之间关系的研究中兴起了免疫治疗这一新的概念,其主要通过增强机体的抗肿瘤免疫应答,被认为最有希望的肺癌治疗策略。然而,由于肺癌的免疫耐受作用,肺癌的免疫治疗并不理想。因此,迫切的需要研究一些新的治疗办法。疟原虫遗传减毒子孢子是一种经遗传操纵方式特异敲除疟原虫肝期发育的必要基因,得到能入侵肝实质细胞,但发育停滞在晚期的子孢子。遗传减毒子孢子能诱导机体产生强烈CD4/CD8+T淋巴细胞反应,有效地抵御子孢子的感染和清除感染肝细胞的疟原虫。那么疟原虫遗传减毒子孢子诱导机体产生的T淋巴细胞免疫反应能否抗肺癌?针对这个问题我们设计了以下实验探讨,是否疟原虫遗传减毒子孢子通过静脉免疫建立的小鼠模型能发挥抗肺癌的作用并初步探讨其机制。一、疟原虫遗传减毒子孢子的获得与鉴定:1、疟原虫遗传减毒子孢子的获得:遗传减毒子孢子获取于第三军医大学病原生物教研室。2、动物体内实验验证疟原虫遗传减毒子孢子是否减毒成功:定义遗传减毒子孢子组为实验组,野生型子孢子组为对照组。将遗传减毒子孢子与野生型子孢子通过尾静脉分别注射3×10~4/200ul给实验组与对照组小鼠,每隔2天/次尾静脉血涂片检查原虫血症。结果发现对照组在第6天出现原虫血症,第14天原虫血症达到30%,而实验组原虫血症一直为0。结果表明遗传减毒子孢子减毒成功。二、探讨疟原虫遗传减毒子孢子抗肺癌的作用:1、遗传减毒子孢子免疫小鼠及LLC细胞的接种:将解剖得到的子孢子稀释为1.5×10~5/ml的浓度,通过尾静脉实验组注射200ul的GAS稀释液,对照组注射含正常按蚊唾液腺同体积的PBS液;2周后将LLC细胞悬液5×10~5/200ul皮下接种于所有小鼠的右侧腹股沟。2、遗传减毒子孢子可以抑制肿瘤生长、延长小鼠生存率:小鼠成瘤后每2天用游标卡尺测量肿瘤的最大直径a及最短横径b(单位为毫米mm),用公式a*b~2/2计算肿瘤体积并记录小鼠的死亡率。结果发现遗传减毒子孢子可以抑制肿瘤的生长(P0.05);且延长GAS组小鼠的生存率(P=0.041)。三、疟原虫遗传减毒子孢子抗肺癌作用的机制研究:1、免疫组化检测肿瘤标本:10%的多聚甲醛固定小鼠肿瘤标本,石蜡包埋切片后,用Ki-67抗体、CD31抗体、Tunel凋亡检测试剂盒,分别检测肿瘤的增殖、血管生成及凋亡情况。结果发现遗传减毒子孢子抑制肿瘤的增殖及血管生成,促进肿瘤细胞的凋亡。2、流式CBA方法-检测小鼠外周血细胞因子实验:用遗传减毒子孢子及含正常按蚊唾液腺的PBS分别免疫小鼠后,分别取免疫后1、3、5、7、9天作为检测点,检测GAS组与PBS组小鼠血清中的IFN-γ,IL-6/12和TNF-α。结果发现所有检测指标均在免疫后快速增加。3、流式细胞仪检测小鼠外周血CD8~+T淋巴细胞:用遗传减毒子孢子及含正常按蚊唾液腺的PBS分别免疫小鼠后,分别取免疫后1、7、14天检测点,流式检测GAS组与PBS组小鼠外周血CD8+T细胞。分离白细胞后用抗体CD8-APC,CD11c-FITC标记。流式检测发现GAS组小鼠CD8+T细胞显著增多。
【关键词】：遗传减毒子孢子 LLC细胞 免疫治疗
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 缩略语表4-5
• Abstract5-8
• 摘要8-10
• 第一章 前言10-12
• 1.1 选题缘由10
• 1.2 研究背景10-11
• 1.3 研究意义11
• 1.4 研究内容11
• 1.5 研究方法11-12
• 第二章 遗传减毒子孢子的获得与鉴定12-15
• 2.1 材料与方法12-13
• 2.2 方法13
• 2.3 结果13-15
• 第三章 探讨疟原虫遗传减毒子孢子抗肺癌的作用15-20
• 3.1 材料与方法15-16
• 3.2 方法16-18
• 3.3 结果18-20
• 第四章 遗传减毒子孢子抗肺癌作用机制的探讨20-33
• 4.1 材料与方法20-21
• 4.2 方法21-25
• 4.3 结果25-29
• 4.4 讨论29-33
• 全文总结33-35
• 参考文献35-38
• 文献综述 寄生虫与肿瘤38-48
• 参考文献42-48
• 攻读硕士学位期间的研究成果48-50
• 致谢50-51

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本文编号：865856