肌醇六磷酸的几种次级磷酸化形式对HT-29细胞体外生长的抑制作用
发布时间:2017-09-16 23:08
本文关键词:肌醇六磷酸的几种次级磷酸化形式对HT-29细胞体外生长的抑制作用
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【摘要】:目的:比较肌醇六磷酸(IP6)的不同次级磷酸化形式对人结肠癌HT-29细胞体外生长的影响,并初步探究其作用的相关机制。方法:1.应用MTT实验检测不同浓度IP3、IP1、IP6作用48h后,对结肠癌HT-29细胞生长的抑制率,并分别计算半数抑制浓度(the half maximal inhibitory concentration,IC50);2.流式细胞术法检测不同浓度IP3和IP6对结肠癌HT-29细胞凋亡的发生率和细胞周期的影响;3.免疫细胞化学法检测不同浓度IP3和IP6对HT-29细胞内PCNA、Bcl-2、Bax表达的影响;4.实时定量PCR(Real time PCR,RT-PCR)检测不同浓度IP3和IP6对细胞癌基因P53、Bcl-2、Bax m RNA表达的影响;5.Western blot检测IP3和IP6作用HT-29细胞后,癌基因P53表达的变化。结果:1.IP3、IP1、IP6均具有抑制HT-29细胞增殖的作用,且IP3、IP1的作用效果均优于IP6(P0.05),尤以IP3的抑制作用最强(P0.05)。IP3、IP1、IP6作用48h对HT-29细胞的IC50值分别为2.3mmol/L、3.3mmol/L、3.5mmol/L。2.IP3和IP6均可使HT-29细胞细胞周期发生G1期阻滞,且随着IP3和IP6干预剂量的增加,HT-29细胞停留在G1期的细胞增加,同空白对照组相比,差别具有显著性(P0.05),其中以IP3的阻滞作用更强。与对照组相比,IP3和IP6各剂量组HT-29细胞凋亡率均有升高,并且随着IP3和IP6干预剂量增加,细胞凋亡率逐渐升高,与IP相比,IP作用组细胞凋亡率更高(P0.05)。3.与对照组相比,不同浓度的IP3和IP6对PCNA的表达均有明显抑制作用,可抑制Bcl-2蛋白的表达,并促进Bax蛋白的表达(P0.05)。且在相同剂量下,IP3的作用较IP6更为明显(P0.05)。4.随着IP3和IP6作用剂量的增加,HT-29细胞P53、Bcl-2 m RNA的表达均降低,Bax m RNA的表达增加,差别具有显著性(P0.05)。且在相同剂量下,IP3的作用效果优于IP6。5.与对照组相比,IP3和IP6组HT-29细胞P53蛋白表达均降低,差别具有显著性(P0.05)。其中以IP3组下调P53蛋白的作用更明显(P0.05)。结论:IP6的次级磷酸化形式均可有效的抑制结肠癌HT-29细胞的生长,且抑制作用效果均优于IP6,其中尤以IP3的作用最明显。IP3可显著的抑制HT-29细胞PCNA、P53、Bcl-2基因的表达,并促进Bax基因的表达,从而起到抑制癌细胞增殖,诱导凋亡的作用,其作用效果显著优于IP6。
【关键词】:肌醇六磷酸 次级磷酸化形式 HT-29细胞 细胞增殖 细胞凋亡
【学位授予单位】:青岛大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R735.34
【目录】:
- 摘要2-4
- abstract4-8
- 引言8-9
- 第一章 材料与方法9-18
- 1.1 实验细胞系9
- 1.2 主要试剂9
- 1.3 主要仪器及设备9-10
- 1.4 细胞培养10
- 1.5 细胞复苏10
- 1.6 细胞传代10
- 1.7 细胞冻存10-11
- 1.8 MTT实验检测IP_3、IP_1、IP_6对结肠癌HT-29细胞增殖的影响11
- 1.8.1 干预方式11
- 1.8.2 实验步骤11
- 1.9 流式细胞术法检测不同浓度IP_3和IP_6对HT-29细胞周期和凋亡的影响11-12
- 1.9.1 干预方式11
- 1.9.2 不同浓度IP_3和IP_6对HT-29细胞周期分布影响11-12
- 1.9.3 Annexin V-FITC/PI双染法检测IP_3和IP_6对HT-29细胞凋亡的影响12
- 1.10 免疫细胞化学法测定不同浓度IP_3和IP_6对HT-29细胞PCNA、Bcl-2 及Bax表达的影响12-13
- 1.10.1 干预方式12
- 1.10.2 实验步骤12-13
- 1.10.3 实验结果判断13
- 1.11 实时定量PCR( RT-PCR)法检测IP_3和IP_6对结肠癌HT-29细胞内P53、Bcl-2、Bax mRNA表达的影响13-15
- 1.11.1 干预方式13
- 1.11.2 总mRNA的提取(Trizol法)13
- 1.11.3 mRNA的纯度及浓度的测定13-14
- 1.11.4 逆转录14
- 1.11.5 PCR扩增14-15
- 1.11.6 引物的设计与合成15
- 1.12 Western Blot检测不同浓度IP_3和IP_6对P53蛋白表达影响15-17
- 1.12.1 干预方式15
- 1.12.2 样品制备15-16
- 1.12.3 BCA法测定各组样品蛋白浓度16
- 1.12.4 Western blot实验操作步骤16-17
- 1.13 统计学处理分析17-18
- 第二章 结果18-31
- 2.1 不同浓度IP_3、IP_1、IP_6对结肠癌HT-29细胞增殖的影响18-19
- 2.2 不同浓度IP_3和IP_6对HT-29细胞周期分布的影响19-21
- 2.3 不同浓度IP_3和IP_6对HT-29细胞凋亡率的影响21
- 2.4 不同浓度IP_3和IP_6对HT-29细胞PCNA蛋白表达的影响21-23
- 2.5 不同浓度IP_3和IP_6对结肠癌HT-29细胞Bcl-2 mRNA及蛋白表达的影响23-26
- 2.6 不同浓度IP_3和IP_6对结肠癌HT-29细胞Bax mRNA及蛋白表达的影响26-28
- 2.7 不同浓度IP_3和IP_6对结肠癌HT-29细胞P53 mRNA及蛋白表达的影响28-31
- 第三章 讨论31-34
- 第四章 结论34-35
- 参考文献35-37
- 综述37-46
- 综述参考文献42-46
- 攻读学位期间的研究成果46-47
- 致谢47-48
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前3条
1 安春绵;吕晓峰;李保义;安凤霞;;中医药治疗原发性肝癌研究进展[J];河北中医;2010年09期
2 张海平;宋扬;;植酸钠对诱癌大鼠结肠黏膜增殖活性的影响[J];齐鲁医学杂志;2006年02期
3 刘晓燕;宋扬;;肌醇六磷酸对结肠癌HT-29细胞分化的影响[J];齐鲁医学杂志;2008年03期
,本文编号:865812
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