miR-27b-5p促进肝癌细胞向肝癌干样细胞转化及其机制研究

发布时间：2017-09-17 04:36

  本文关键词：miR-27b-5p促进肝癌细胞向肝癌干样细胞转化及其机制研究

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【摘要】：研究背景与目的:肝癌是世界上最常发生的恶性肿瘤之一,其疗效差,复发率高,预后不良,原因可能与肿瘤中存在的一小部分具有自我更新和多向分化能力的肿瘤干细胞有关。mi RNAs是一类单链非编码RNA,其长约20-24个核苷酸,在转录后水平发挥调节基因的作用。近年来,已经证实mi RNA在肿瘤干细胞及肿瘤的发生发展过程中发挥重要的作用,它们可能作为肿瘤潜在的分子治疗靶点。在前期研究中,我们已经利用mi RNA芯片技术筛选出肝癌干样细胞与肝癌细胞中mi RNAs的差异表达谱。接下来我们旨在从mi RNAs的差异表达谱中找出与肝癌干样细胞相关的mi RNA,并研究其对肝癌细胞及肝癌干样细胞的影响及其作用机制,为肝癌的诊治提供新的方向。方法:第一部分:参与肝癌细胞向肝癌干样细胞转化过程mi RNA的筛选及验证1应用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcriotion-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法在Huh7肝癌细胞及肝癌干样细胞中验证部分芯片结果。2应用RT-PCR方法在肝癌组织及癌旁肝组织中验证部分芯片结果。第二部分:mi R-27b-5p对肝癌细胞向肝癌干样细胞转化的肿瘤生物学功能研究1应用慢病毒感染技术构建mi R-27b-5p过表达的肝癌细胞。2应用CCK-8细胞增殖实验、划痕实验、克隆形成实验、Transwell细胞侵袭实验等实验方法和技术检测mi R-27b-5p在体外实验中对肝癌细胞生物学的影响。3应用单细胞成球实验、RT-PCR等实验方法和技术检测mi R-27b-5p在体外实验中对肝癌干样细胞干性的影响。第三部分:mi R-27b-5p促进肝癌细胞向肝癌干样细胞转化的机制研究1通过DIANA、MICRORNA、MIRDB、PICTAR、Target Miner、RNA22等生物信息学软件预测mi R-27b-5p调控的下游靶基因。2应用定量RT-PCR方法检测mi R-27b-5p与靶基因在m RNA水平上的相关性。3应用Western Blot方法检测mi R-27b-5p与靶基因在蛋白水平上的相关性。4应用双萤光素酶报告基因实验验证mi R-27b-5p对靶基因的直接调控作用。结果:第一部分:参与肝癌细胞向肝癌干样细胞转化过程mi RNA的筛选及验证1在前期研究中,通过mi RNA芯片技术初步获得肝癌干样细胞与肝癌细胞mi RNAs的差异表达谱,对芯片结果进行分析,肝癌干样细胞与肝癌细胞相比,差异十倍以上的mi RNA有35个,上调10个,下调25个,运用定量RT-PCR方法检测mi R-27b-5p在Huh7肝癌细胞及肝癌干样细胞中的表达与芯片结果一致。2运用定量RT-PCR方法检测mi R-27b-5p在肝癌组织及癌旁肝组织中的表达与芯片结果一致。第二部分:mi R-27b-5p对肝癌细胞向肝癌干样细胞转化的肿瘤生物学功能研究1 mi R-27b-5p过表达慢病毒感染Huh7肝癌细胞,感染72h后,mi R-27b-5p组和对照慢病毒(NC)组均出现明显绿色荧光蛋白表达,提示慢病毒感染成功。将感染后的肝癌细胞提取总RNA,进一步行定量RT-PCR检测,mi R-27b-5p组目的基因的表达明显高于NC组和空白对照(Blank)组,具有显著的统计学意义(P0.01),表明过表达mi R-27b-5p成功。2通过慢病毒载体在肝癌细胞中过表达mi R-27b-5p成功后,进行一系列肿瘤细胞生物学行为检测:CCK-8细胞增殖实验发现过表达mi R-27b-5p可促进Huh7肝癌细胞的增殖(P0.05);平板克隆实验发现过表达mi R-27b-5p可促进Huh7肝癌细胞的克隆形成(P0.01);划痕实验发现过表达mi R-27b-5p可促进Huh7肝癌细胞的迁移(P0.05);Transwell细胞侵袭实验发现过表达mi R-27b-5p可促进Huh7肝癌细胞的侵袭(P0.01)。此外,对过表达mi R-27b-5p的肿瘤细胞在干性方面的变化进行检测:单细胞成球实验发现过表达mi R-27b-5p可促进肝癌干样细胞的自我更新(P0.01)。定量RT-PCR实验发现过表达mi R-27b-5p可促进肝癌细胞干性基因的表达(P0.01)。第三部分:mi R-27b-5p促进肝癌细胞向肝癌干样细胞转化的机制研究1通过DIANA、MICRORNA等生物信息学软件分析发现FOXO1可能是mi R-27b-5p的下游靶点。FOXO1已被证实是哺乳动物细胞中重要的抑癌基因。2定量RT-PCR结果显示过表达mi R-27b-5p肝癌细胞中的FOXO1m RNA表达水平相比于NC组和Blank组肝癌细胞明显降低,具有统计学差异(P0.01)。3 Western Blot结果显示过表达mi R-27b-5p肝癌细胞的FOXO1蛋白表达水平相比于NC组和Blank组肝癌细胞明显降低,而NC组与Blank组之间无明显差异。4双萤光素酶报告基因实验结果显示相对于FOXO1-Mut组,mi R-27b-5p mimics的作用后,FOXO1-WT组的FOXO1-3’UTR质粒的表达趋势降低。结论:1 mi R-27b-5p不仅可促进肝癌细胞的增殖、侵袭与迁移,而且可促进肝癌干样细胞的自我更新与肝癌细胞干性基因的表达。2生物信息学软件预测FOXO1可能是mi R-27b-5p的下游靶点。3 mi R-27b-5p与FOXO1的表达具有显著相关性,且通过与FOXO1-3′UTR直接结合,抑制FOXO1的表达,从而发挥调控作用。
【关键词】：肝癌 肝癌干样细胞 mi R-27b-5p 增殖 侵袭 迁移 自我更新 FOXO1
【学位授予单位】：四川医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-15
• 第一部分：参与肝癌细胞向肝癌干样细胞转化过程mi RNA的 筛选及验证15-25
• 材料与方法15-21
• 结果21-23
• 讨论23-24
• 结论24-25
• 第二部分：miR-27b-5p对肝癌细胞向肝癌干样细胞转化的肿瘤生物学功能研究25-42
• 材料与方法25-32
• 结果32-39
• 讨论39-40
• 结论40-42
• 第三部分：miR-27b-5p促进肝癌细胞向肝癌干样细胞转化的机制研究42-53
• 材料与方法42-47
• 结果47-50
• 讨论50-52
• 结论52-53
• 全文结论53-54
• 参考文献54-61
• 英汉缩略词对照表61-64
• 致谢64-66
• micro RNA与肿瘤干细胞的研究进展（综述）66-78
• 参考文献73-78

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 钟阿红;许希中;余进进;吴亦波;;miR-124在肿瘤研究中的进展[J];基础医学与临床;2015年04期

2 柳长青;徐汉杰;周颖;赵卫东;;miR-199在对顺铂敏感性不同的卵巢癌细胞株中的表达及其意义[J];中国临床保健杂志;2015年03期

3 刘伟;黄军;郑龙;陈佳琪;杨飞;贺大林;李磊;;MicroRNA-27b在良性前列腺增生和前列腺癌组织中的的表达研究[J];现代泌尿外科杂志;2015年10期

4 李仕勇;;人类癌症基因组的检验分析与临床应用[J];检验医学;2014年05期

5 李韵;李华;吴敬波;张涛;;微小RNA与肿瘤干细胞的研究进展[J];肿瘤预防与治疗;2014年02期

6 冯世宇;朱伟杰;余新光;;lncRNA在胶质瘤发生发展中的作用机制研究进展[J];山东医药;2014年18期

7 罗渊;田亚平;;microRNA的调控和被调控[J];中国生物化学与分子生物学报;2014年12期

8 赵源源;李华;吴敬波;张涛;;microRNA在肝癌发生发展及诊治中的作用[J];肿瘤预防与治疗;2015年01期

9 赵皓琦;贺斌;王介东;刘书言;徐祥波;;宫颈癌相关microRNAs表达调控机制的研究进展[J];生殖医学杂志;2015年03期

10 Benjamin Wolfson;Gabriel Eades;Qun Zhou;;Adipocyte activation of cancer stem cell signaling in breast cancer[J];World Journal of Biological Chemistry;2015年02期

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 漆剑;microRNA调控Notch信号通路在白塞氏病发病机制中的作用及其遗传易感性研究[D];重庆医科大学;2013年

2 邵新宏;MiR-34a靶向调控NOTCH1基因对SW480细胞增殖影响及其机制[D];重庆医科大学;2013年

3 金铮;miR-125b在神经胶质瘤中的作用及机制研究[D];吉林大学;2014年

4 王琦;J亚群禽白血病病毒致病性增强的分子机制[D];中国农业科学院;2014年

5 刘武韬;肝细胞癌1ncRNA表达谱研究[D];北京协和医学院;2014年

6 刘非;HPV16 E7调控MicroRNA-27b影响宫颈癌细胞增殖和凋亡的机制研究[D];南方医科大学;2014年

7 刘军;调节性T细胞对乳腺癌细胞干细胞特征及EMT的影响与调控机制研究[D];天津医科大学;2014年

8 苏婧;miR-217靶向调控E2F3在肝细胞癌侵袭转移中的作用研究[D];中南大学;2014年

9 袁源;miRNA-145在胆囊癌发病过程中的调控作用及机制研究[D];中南大学;2014年

10 王正光;miRNA-210及其靶基因EFNA3对恶性外周神经鞘瘤（MPNST）的增殖和侵袭能力的机制研究[D];中南大学;2014年

中国硕士学位论文全文数据库 前9条

1 漆仲春;MiRNA在肝癌干细胞和肝癌细胞中差异表达谱的研究[D];泸州医学院;2013年

2 贺元晨;基于RNA结合蛋白的MicroRNA富集与检测技术的研究[D];华东理工大学;2014年

3 沈旦;MiR-205调控非小细胞肺癌细胞发生上皮—间充质转化过程的机制研究[D];苏州大学;2014年

4 周胤余;miRNA-29b在宣威肺癌中的表达及功能研究[D];昆明医科大学;2014年

5 聂静;Has-miR-339-5p对乳腺癌增殖能力的影响[D];安徽医科大学;2014年

6 张诗蒙;HPV16 E7调控miR-27b-PPARγ-NHE1途径影响宫颈癌细胞增殖与侵袭功能的实验研究[D];南方医科大学;2014年

7 孙静;胶质瘤miR-29s表达异常减少对其DNMT3A/3B的影响及其机制研究[D];天津医科大学;2014年

8 李琳;甲基丙二酸血症患者血浆循环microRNAs表达谱研究[D];郑州大学;2014年

9 葛莹;自身免疫病的表观遗传学[D];复旦大学;2013年

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本文编号：867299