Elp3依赖HAT活性参与肝癌发生发展的机制研究

发布时间：2017-09-17 05:26

  本文关键词：Elp3依赖HAT活性参与肝癌发生发展的机制研究

  更多相关文章： Elp3 序列敲除 迁移侵袭 损伤修复

【摘要】：目的:构建Elp3序列敲除重组表达质粒,通过与过表达Elp3及干扰Elp3质粒组对比,研究Elp3蛋白在肝癌发生发展中的作用与其HAT结构域和参与Elongator复合体构建的关系。方法:1.测序及双酶切鉴定PIRES2-EGFP-Elp3及四个序列敲除重组表达质粒。2.RT-PCR、western blot鉴定293a细胞及HepG2细胞瞬时转染各组质粒后,目的基因mRNA,蛋白表达。3.通过Real-time PCR、western blot检测HepG2细胞瞬时转染各组质粒后,Elp3 mRNA,蛋白表达水平。4.CCK-8检测各组细胞增殖能力的变化情况。5.划痕实验检测各组细胞迁移能力的变化情况。6.Transwell实验检测各组细胞迁移、侵袭能力的变化情况。7.以OTM为指标,彗星电泳检测辐照后各组细胞DNA损伤修复情况。8.Western blot检测各组细胞Elp3、Elp4、AKT、p-AKT、MMP2、MMP9等指标的变化情况。结果:1.测序及双酶切鉴定表明,插入表达重组载体中的目的基因序列准确,长度无误:elp3-d1(1374bp),elp3-d2(1110bp),elp3-d3(1239bp),elp3-d4(636bp),elp3(1692bp)。2.RT-PCR检测结果表明,重组表达载体中的目的基因能够表达出正确的mRNA;western blot检测结果表明,重组表达载体中的目的基因在293a细胞及HepG2细胞中均能正确表达目的蛋白:Elp3-d1(50kDa),Elp3-d2(40k Da),Elp3-d3(45kDa),Elp3-d4(27kDa),Elp3(62kDa)。3.Real-time PCR检测及Western blot检测结果表明,表达载体中序列基因表达1出的目的蛋白并没有影响细胞中内源性elp3mrna、蛋白表达,elp3-d1、elp3-d2、elp3-d3、elp3-d4组表达量与hepg2组比,差异没有统计学意义;elp3过表达组细胞内elp3蛋白表达增高,elp3干扰组(elp3i)细胞内elp3蛋白表达减少。4.cck-8检测结果显示,相比于hepg2组,elp3干扰组及过表达elp3-d1蛋白的细胞增殖能力显著下调;过表达elp3、elp3-d3蛋白的细胞增值能力显著增强;过表达elp3-d2、elp3-d4蛋白的细胞无显著差异。5.划痕实验检测结果显示,相比于hepg2细胞,elp3干扰组及过表达elp3-d1蛋白的细胞迁移能力下降;过表达elp3、elp3-d3蛋白的细胞迁移能力明显增强;过表达elp3-d2、elp3-d4蛋白的细胞无显著差异。6.transwell实验检测结果显示,相比于hepg2细胞组,elp3干扰组及过表达elp3-d1蛋白细胞,迁移能力减弱,穿膜侵袭能力下调;过表达elp3、elp3-d3蛋白的细胞迁移能力增强,穿膜侵袭能力增强;过表达elp3-d2、elp3-d4蛋白的细胞无显著差异。7.彗星电泳检测结果发现,8gy/min剂量辐照后,相比于hepg2细胞,elp3干扰组及过表达elp3-d1蛋白的细胞,在损伤后修复速度及修复能力上下降明显;过表达elp3、elp3-d3蛋白的细胞修复速度提高,修复能力增强;过表达elp3-d2、elp3-d4蛋白的细胞无显著差异。8.westernblot检测各组细胞,elp3、elp4、akt、p-akt、mmp2、mmp9表达水平。结果发现,相比于hepg2细胞组,elp3干扰组及过表达elp3-d1蛋白的细胞组,akt激活水平及下游mmp2、mmp9蛋白表达水平略有下调;过表达elp3、elp3-d3蛋白的细胞组,akt激活水平及下游mmp2、mmp9蛋白表达量提高;过表达elp3-d2、elp3-d4蛋白的细胞组内相关蛋白无显著差异。结论:1.成功构建elp3过表达质粒及序列敲除重组表达质粒,正确表达出目的蛋白。2.重组表达质粒表达出的目的蛋白不影响elp3内源性表达。3.elp3蛋白在肝癌细胞中促进增殖,促进迁移侵袭,促进dna损伤修复等作用依赖其hat活性。4.elp3激活akt信号通路依赖elongator复合体结构完整性及hat功能完整性。5.Elp3参与细胞多种活动,可能是通过乙酰化引起基因激活而非直接作用于信号通路完成的。
【关键词】：Elp3 序列敲除 迁移侵袭 损伤修复
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 引言12-14
• 第一部分 Elp3重组表达质粒的构建及鉴定14-35
• 1 材料与方法15-22
• 1.1 材料15
• 1.2 主要仪器设备15-16
• 1.3 实验方法16-22
• 2 实验结果22-33
• 2.1 预测确定敲除序列序列并成功构建真核表达载体22-25
• 2.2 重组质粒的酶切鉴定25-26
• 2.3 重组质粒的基因测序鉴定26-30
• 2.4 RT-PCR检测重组质粒相关基因表达30
• 2.5 Western blot检测重组质粒蛋白表达30-33
• 3 讨论33-35
• 第二部分 Elp3促进HCC细胞迁移侵袭及DNA损伤修复35-58
• 1 材料与方法36-44
• 1.1 材料36-37
• 1.2 主要仪器设备37
• 1.3 实验方法37-44
• 2 实验结果44-55
• 2.1 Real time PCR检测瞬时转染后Elp3 mRNA表达情况44-45
• 2.2 Western blot检测瞬时转染后Elp3蛋白表达情况45-46
• 2.3 CCK-8 检测瞬时转染重组表达质粒后Hep G2细胞增殖情况46-47
• 2.4 划痕实验检测HepG2细胞中转染重组质粒后细胞的迁移能力47-48
• 2.5 transwell实验检测HepG2细胞中转染重组质粒后细胞的迁移侵袭能力48-49
• 2.6 ~(60)Coγ射线辐照的最适剂量49-50
• 2.7 彗星电泳分析转染重组质粒对基因组的影响50-52
• 2.8 HepG2细胞中转染重组质粒后侵袭迁移相关蛋白表达水平52-55
• 3 讨论55-58
• 结论58-59
• 参考文献59-62
• 综述:Elongator复合体的结构和功能62-73
• 参考文献69-73
• 展望73-74
• 本文受以下基金资助74-75
• 缩略词表75-76
• 致谢76-77

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本文编号：867521